动物细胞的冷冻保存

任务1　动物细胞的冷冻保存

在体外培养过程中，常需要对细胞进行冷冻保存以减少工作量，防止细胞因传代过多发生变异甚至死亡。冷冻保存的细胞可为进行某个方面的重复实验提供永久的材料来源。

目前，细胞冷冻保存最常用的技术是液氮冷冻保存法，使用的冷冻剂是液氮，其温度是-196℃，在-70℃以下时，细胞内的酶活性均已停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。这是大多数细胞样品的最佳储存温度，理论上储存时间可以是无限长的。例如，人的红细胞在液氮中可储存12年而不表现出明显的生化及生理功能变化。液氮对细胞材料的pH值没有影响，气化时也无残留物。

冷冻保存的条件和方法将直接影响细胞复苏后的生存率，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冷冻保存细胞。为了保持细胞最大的存活率，一般采用慢冻快熔的方法。缓慢降温可使细胞外液先冻结出现冰晶，细胞发生脱水，细胞内不出现冰晶。

一、冷冻保存的原理

在不加任何保护措施的条件下直接冷冻保存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH值改变、蛋白质变性等，能引起细胞死亡。如向培养液中加入保护剂，可使冰点降低。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成量。目前细胞冷冻保存多采用二甲基亚砜（DMSO）或甘油作保护剂，这两种物质对细胞毒性小，相对分子质量小，溶解度大，易穿透细胞，能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞，减少细胞内冰晶的形成量，从而减少冰晶形成造成的细胞损伤。

在一般低温条件下，活细胞内外可出现对细胞有机械损伤作用的冰晶，而且随着冰晶数量的增多，会导致细胞脱水及渗透压上升等后果，这些也可造成细胞的损伤。储存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成量。

在体外培养的细胞，从增殖期到形成致密单层前的细胞都可用于冷冻保存，但一般认为处于对数生长期的细胞用于冷冻保存效果最佳。

当需要使用冷冻保存的细胞时，可加温使之复苏，复苏后的细胞可继续培养增殖用于研究或实验。冻结的细胞复苏要以快速熔化为原则，使之迅速通过细胞最易受损伤的温度区（-5～0℃），以防小冰晶变为大冰晶而对细胞造成损伤。

二、影响冷冻保存效果的因素

在细胞的冷冻保存过程中，冷冻速率、冷冻保存温度、冷冻保护剂、细胞密度、复温速率等都对细胞活力有影响。

1.冷冻速率

冷冻速率是指降温的速度，它直接关系到冷冻效果。细胞冷冻过程中的冷冻速度不同，细胞内水分向细胞外流动的情况会不同。如果冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，细胞内溶质浓度增高，细胞内不发生结冰；如果冷冻速度快，细胞内水分没有足够的时间外渗，结果随着温度的下降而发生细胞内结冰，会对细胞造成损害。

为了减少冰晶对细胞的伤害，保证冷冻保存效果，选择最佳的降温程序和速度很重要。目前常用的降温程序是分段降温法，即利用不同温级的冰箱或液氮储存罐，将活细胞在不同的温度段分段降温冷却，例如，先从室温降至4℃，再依次降至-40℃、-80℃、-196℃（在各温度段持续时间视细胞的类型而定）。关于最佳降温的速度，不同类型的细胞相差较大，与细胞的性质，特别是质膜的渗透率有关。一般来说，以每分钟1～10℃的速度降温可得到良好的效果。

2.冷冻保存温度

不同的细胞和生物体以及使用不同的冷冻保存方法要取得同样的冷冻保存效果，冷冻保存温度可以不同。但从现实性和经济性考虑，液氮温度（-196℃）是目前最佳冷冻保存温度。在-196℃时，细胞生命活动几乎停止，但复苏后细胞结构和功能完好。

3.冷冻保护剂

冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质，常常配制成一定浓度的溶液，作为冷冻保护液。冷冻保护剂可分为渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂两类。渗透性冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是小分子物质。该类保护剂主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是大分子物质。该类保护剂主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羟乙基淀粉等。由于许多冷冻保护剂（如DMSO）在低温条件下能保护细胞，在常温下却对细胞有害，故在细胞复温后要及时洗去冷冻保护剂。

三、冷冻保存的方法

细胞的冷冻保存如图1-59所示。

1.冷冻保存前处理

（1）准备20%DMSO冷冻保存液，用20%小牛血清培养液配制。

（2）混匀细胞悬液和冷冻保存液。单层细胞培养物（冷冻保存前一天，细胞换液）经胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，细胞活力为95%。调节细胞密度为1×10⁴～1×10⁷个／mL，1000r／min离心20s，去上清液。弹指法分散沉淀细胞后，左手摇动离心管，右手逐滴加入与细胞悬液等量的20%DMSO的培养液（DMSO最终使用浓度为10%，血清最终使用浓度为8%）。

图1-59　细胞的冷冻保存

（3）分装。将细胞悬液分装于2mL冻存管（图1-60）中（注意拧紧管盖，管不要倒下）。密封后，标记冷冻细胞名称和冷冻日期。使用国产液氮罐（图1-61）时，冻存管要用白布包扎，布袋系以线绳。布表面和绳头末端再做好标记，以便日后查找。

图1-60　细胞冻存管

图1-61　液氮罐及其使用

2.冷冻保存方法

（1）传统方法：将冻存管置于4℃30min，-20℃30min，-80℃过夜，液氮罐中长期储存。-20℃不可超过1h，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，也可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，但存活率会稍微降低一些。

（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-3～-1℃／min的速度由室温降至-80℃以下，再放在液氮罐中长期储存。

知识拓展

二甲基亚砜

二甲基亚砜（DMSO）是一种含硫有机化合物，分子式为（CH₃）₂SO，常温下为无色无臭的透明液体，是一种吸湿性的可燃液体，具有极性高、沸点高、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性。DMSO是一种既溶于水又溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等有机溶剂的极为重要的非质子极性溶剂，被誉为“万能溶剂”。DMSO对皮肤有极强的渗透性，有助于药物向人体渗透，能促进药物吸收和提高疗效，因此在国外被称为“万能药”。将各种药物溶解在DMSO中，不用口服和注射，涂在皮肤上就能渗入体内，这开辟了给药新途径。DMSO也是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成量，减轻自由基对细胞的损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。

玻璃化保存

玻璃化保存（vitrification）是一种超速冷冻方法。它是以极快的速度冷冻细胞，使细胞内外的游离水迅速形成玻璃样物质，而不形成冰晶。这种保存方法既可避免慢速降温导致的盐浓度升高，又可防止冰晶造成的物理损伤，可获得较高的细胞存活率。

思考题

1.影响冷冻保存效果的因素有哪些？

2.冷冻保存液的作用是什么？

3.如何配制细胞冷冻保存液？

4.为何在进行细胞冷冻保存前一天最好换液？

5.细胞冻存管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？