任务2 动物细胞的复苏
细胞在液氮中可保存数年或数十年。冷冻保存体外培养物，除了必须有最佳的冷冻速率、合适的冷冻保护剂和冷冻保存温度外，在复苏时也必须有最佳的复温速率，这样才能保证最后获得最佳冷冻保存效果。
一、细胞复苏基础知识
细胞复苏与冷冻保存的要求相反，应采取快速熔化的手段。复苏时熔化细胞速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的温度区（-5～0℃），这样可以保证细胞外的结晶在很短的时间内熔化，以免缓慢熔化时水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害，甚至引起细胞死亡。复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。复温速率选择不当也会降低冷冻保存细胞的存活率。一般来说，复温速度越快越好。常规的做法是，在37℃水浴中，于1～2min内完成复温。复温速度过慢，细胞内会重新形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细胞损伤非常快，往往在极短的时间内发生。
冷冻保存的细胞并非都能复苏成功。其失败原因可能与以下因素有关：①冷冻保存时细胞数量少或生长状态不良；②细胞被细菌或支原体污染；③液氮罐保管不善；④复苏时培养条件改变；⑤复苏方法不得当。
二、细胞的常规复苏培养方法
细胞的复苏在一般情况下采用常规复苏法，一般操作如下：从液氮罐中取出冷冻保存细胞，迅速放入37℃水浴中，并不时摇动，在1min内使其完全熔化，然后在无菌条件下离心5～10min，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，置于37℃培养箱中培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况；或不经离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24h后，弃去上清液，换入新鲜培养基继续培养。细胞的复苏如图1-62所示。
图1-62 细胞的复苏
三、注意事项
（1）防止玻璃冻存管在冰浴后爆炸（液氮进入管内之故），在熔化前不要拆除包管布袋。实验人员在细胞复苏操作时应戴护目镜和口罩，应有自我保护意识，避免被液氮冻伤。
（2）冷冻保存细胞悬液一旦熔化后，要尽快离心弃去冷冻保护液，防止冷冻保护剂对细胞产生毒性。
（3）复苏细胞没有污染、活力高时，通常30min内贴壁。
（4）复苏细胞瓶内常见细胞背景不清晰，有死亡细胞颗粒、碎片的现象。此现象在经长时间运输后或长久冷冻保存的细胞瓶内尤为明显。通过低速、短时间离心培养和多次换液，细胞背景逐渐清晰，细胞恢复生长特征。
知识拓展
十分钟的细胞活性检测
Life Technologies公司近日推出了一种PrestoBlueTM细胞活性检测试剂，能在10min内获得高质量的细胞活性结果。PrestoBlue试剂是一种基于刃天青（resazurin）的即用型溶液。它利用活细胞的还原能力来定量测定细胞的增殖，从而指示细胞活性。PrestoBlue试剂中包含一种细胞通透性的化合物，这种化合物是蓝色的，且几乎没有荧光。在加入细胞后，PrestoBlue试剂被活细胞的还原环境所修饰，变成红色，且荧光很强。利用荧光或吸光度测量，可检测这种变化。整个分析流程可在10min内完成。首先，准备好一块待测的96孔板。然后，直接向细胞中加入PrestoBlue试剂，并在37℃培养10min。最后，将平板转移到分析仪中，测定信号。通过将信号与化合物浓度作图，可评估结果。
思考题
1.细胞复苏后如何计算存活率？
2.细胞复苏过程中为何要去除冷冻保存液？
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
