鸡胚成纤维细胞的原代培养

项目五　鸡胚成纤维细胞的原代培养

一、项目背景

原代培养是指在体外模拟体内生理环境，使从体内取出的组织细胞生存、生长和传代，并维持原有组织细胞的结构和功能特性。鸡胚成纤维细胞具有相对容易获得、增殖能力强、适应性强、耐受性良好、性状比较稳定等特点，被用来生产各种鸡的疫苗，如传染性法氏囊病、马立克氏病、新城疫疫苗等，也被用来表达一些基因工程产物。鸡胚成纤维细胞的原代培养在分子生物学、细胞学、遗传学、免疫学、肿瘤学及细胞工程学等领域，已发展成为一门重要的生物技术，并取得显著成就。

二、项目目标

（1）了解动物细胞培养的取材与分离方法；

（2）掌握细胞计数技术及细胞密度换算方法；

（3）掌握鸡胚成纤维细胞原代培养操作及常规观察方法；

（4）培养学生严谨认真的实验态度和团队合作精神。

三、工作流程

流程一：材料准备

流程二：鸡胚的孵育

将受精鸡卵放在蛋托上，大头（气室）朝上，入培养箱培养。在培养箱底部放上一盘水，将温度调至37.8℃，孵育9～11d，选择合适鸡胚备用。

流程三：操作方法

（1）取选择好的鸡胚2～3个，放入超净工作台中，大头朝上放置，依次用碘酒棉和酒精棉消毒气室部位。

（2）用镊子先剥去气室部蛋壳，换一把镊子撕开尿囊膜及羊膜，再换一把镊子小心取出鸡胚，放入无菌培养皿中，去除头部，然后用弯头眼科镊夹起腹部皮肤，剪开腹腔和胸腔除去内脏，用Hank′s液清洗2～3次，吸去液体，洗去红细胞。

（3）用小剪刀将鸡胚反复剪碎成泥状，加Hank′s液，吸入细胞培养瓶，稍静置，让组织下沉，吸去液体。用Hank′s液清洗2～3次，吸去液体，洗去红细胞。

（4）加入适量0.25%胰蛋白酶溶液，胰蛋白酶的量以能将组织浸泡在胰蛋白酶中为度，一般每个鸡胚加20mL消化液，盖好橡皮塞，置于37℃水浴中消化20～30min，消化时每隔5min摇动一次，使组织块散开。当组织块变得疏松、颜色略变白时，从水浴中取出。

（5）消化完毕，在超净工作台中用吸管轻轻吸去消化液，加入2～3mL含小牛血清的培养液，以终止消化。用Hank′s液洗三次以洗去胰蛋白酶，吸去洗液。然后用吸管反复吹打，使大部分组织块分散成单细胞状态，静置片刻，使得未被消化完的组织自然下沉，然后将上层液通过100目不锈钢筛网，制备细胞悬液。将细胞悬液移入无菌离心管中备用。

（6）离心（1000r／min，10min），弃去上清液，加入适量培养液，用吸管反复吹打成细胞悬液，用细胞计数法计算每毫升营养液中的细胞数，根据所计算的细胞数，将原液稀释至浓度为1×10⁶个／mL。将稀释好的细胞悬液接种于培养瓶中，培养液的量以覆盖瓶底为度。

（7）将培养瓶置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。培养时，培养瓶的盖不要拧得太紧，以不会往下掉为度，以便CO₂进入。细胞贴壁后延展成长梭形，培养7～10d即可长成致密单层细胞。

流程四：物品的清洗与归位、实验室的整理等

实验结束后，应将实验用器材根据情况进行清洗、整理归位、摆放整齐，打扫实验场地的卫生。

四、工作注意事项

（1）操作时要特别注意无菌操作，以防微生物污染而导致培养失败；

（2）细胞接种浓度不宜过大，否则会影响细胞贴壁和生长；

（3）培养后要注意细胞状态，出现异常情况及时处理。

五、思考题

（1）试述原代培养的概念及优点。

（2）解离释放细胞的方法有哪几种？各有何优缺点？

（3）试述鸡胚成纤维细胞原代培养的操作注意事项。

（4）提示需要更换培养液的因素有哪几点？