的传代培养

项目九　MDCK细胞（犬肾细胞）的传代培养

一、项目背景

传代培养是组织培养的常规保种方法之一，也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，这样细胞才能继续生长。传代培养可获得大量细胞供实验所需。

当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞的不断分裂，一方面，细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面，也会因营养物不足和代谢产物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代或者再培养。对单层培养而言，细胞80%汇合或接近全汇合是较理想的传代阶段。

MDCK细胞属长耳短尾猎犬肾细胞株，它使用的培养基是最常见的DMEM，加10%的小牛血清。37℃，0.5%CO₂培养。MDCK细胞常用来分离和培养流感病毒等。

二、项目目标

（1）掌握动物细胞的传代培养方法；

（2）掌握贴壁细胞的传代操作技术；

（3）培养学生严谨的实验态度。

三、工作流程

流程一：工作准备

续表

流程二：操作方法

（1）取80%汇合或接近全汇合的MDCK细胞，使培养瓶的细胞面向上，将培养液倒入盛污物的三角瓶内（或用吸管吸出培养液），用约2mL Hank′s液清洗2～3次。

（2）向培养瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液约2mL，37℃下消化。

（3）室温下，将培养瓶置于倒置显微镜下观察，当发现细胞质回缩，细胞与细胞之间相互接触松散、间隙增大，细胞变圆或出现蜘蛛网状结构时，立即将培养瓶直立，终止消化（约3min）。用肉眼观察时可见培养瓶的细胞面出现类似水汽的一层结构，即出现发雾现象。这是由于细胞被消化后部分细胞质回缩，细胞与细胞间出现间隙，有细胞的地方透光性降低，无细胞的地方透光性增加，使得细胞面透光性变得不均匀，产生水汽样结构。

（4）向瓶内加入等量含小牛血清的培养液中止消化。拍打培养瓶，促使已松动的细胞从瓶壁脱落。然后用吸管将细胞从瓶壁吹打下来，1000r／min离心10min，去除胰蛋白酶。

（5）离心完毕，加培养液5mL。

（6）细胞悬液按1∶2或1∶3的比例分配，接种到2～3个培养瓶内，再向各瓶补加营养液至5mL，置于培养箱中培养（做好标记）。此后每3d换液1次，并注意观察MDCK细胞传代培养后的形态变化。

四、工作注意事项

（1）注意操作中的一些细节，如培养液等不能过早开瓶，移液管、吸管勿碰用过的培养瓶口，要勤过火焰，尤其是瓶口；

（2）注意胰蛋白酶消化时间不能过长，否则会造成细胞数目上的损失，也会对细胞造成损伤；

（3）根据细胞的密度、生长速度及实验周期的要求适当调整细胞的接种密度；

（4）如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃去污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗，随后在培养基中加入较大量的抗生素，并经常更换培养基等。

五、思考题

（1）细胞传代培养的目的是什么？

（2）若细胞消化不足或过消化，应该如何操作才能尽可能保证细胞的数目？

（3）观察传代培养后不同时期细胞形态的变化，并与原代培养细胞进行比较。

（4）如何估计是否需要传代和确定传代的方式？