PRRSV的Marc145的细胞培养

PRRSV的Marc145细胞培养

一、项目背景

细胞培养在病毒学方面的应用最为广泛，除用于病毒的病原分离外，还可用于研究病毒的繁殖过程及细胞的敏感性和传染性，观察病毒传染时细胞新陈代谢的变化，探究抗体与抗病毒物质对病毒的作用方式与机制，研究病毒干扰现象的本质和变异的规律性，以及病毒的分离和鉴定，抗原的制备及疫苗、干扰素的生产，病毒性疾病诊断和流行病学调查等。

PRRS——猪繁殖与呼吸障碍综合征（俗称蓝耳病），以妊娠母猪的繁殖障碍（流产、死胎、木乃伊胎）及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病为特征，现已成为规模化猪场的主要疫病之一。PRRSV（猪蓝耳病病毒）为一种有囊膜的病毒，呈球形或卵圆形，直径为45～65nm，呈20面体对称，囊膜表面有较小的纤突，表面相对平滑，核衣壳为立方形，核心直径为25～35nm。

Marc145细胞（恒河猴肾细胞）为上皮样细胞，可连续培养。PRRSV在Marc145细胞上生长可产生细胞病变效应（CPE）。PRRSV感染Marc145细胞过程可大致分为两个阶段：第一阶段，病毒感染细胞后的20～22h，仅部分细胞被随机感染，而且Marc145细胞对PRRSV的低感染性与感染剂量无关，因为感染剂量比常规量提高100倍，感染22h后，仅5.5%的细胞呈PRRSV阳性；第二阶段，感染后的2～3d，也称为病毒的对数感染期，病毒感染蔓延是通过相邻细胞之间的接触感染，细胞对自由病毒不敏感，并出现感染细胞群。

二、项目目标

（1）掌握病毒性材料的处理方法；

（2）掌握PRRSV接种于组织培养细胞的技术；

（3）掌握病毒的细胞培养技术；

（4）掌握细胞病变的观察方法；

（5）培养学生良好的实验习惯。

三、工作流程

流程一：工作准备

续表

流程二：制备病毒悬液

（1）将含PRRSV的病料剪碎、充分研磨，加生理盐水制备成1∶10匀浆，反复冻熔3次，3000r／min离心，取上清液，过滤除菌，每毫升加青霉素1000μg和链霉素1000μg，室温放置1～2min。

（2）将病毒液反复冻熔3次，3000r／min离心10min，取上清液。

流程三：病毒感染和维持

（1）将Marc145细胞培养长成单层。

（2）弃去细胞培养生长液，用预热至37℃的Hank′s液（pH 7.2～7.4）清洗1次，以除去细胞碎片等。

（3）滴加病料上清液（或病毒悬液），接种量为生长液的1／10，标准是使细胞单层都能接触病毒。在37℃下放置1～2h，使病毒吸附于细胞膜。期间可以转动细胞培养瓶2～3次，目的是使全部细胞都接触到接种物。同时做细胞对照试验。

（4）弃去接种液，用pH 7.2的Hank′s液将细胞单层清洗2～3次，以除去接种液内可能存在的对细胞有毒的物质，如接种粪便等病料尤其要注意。如果接种液就是细胞培养传代病毒，则可省略此步骤。

（5）按生长液量换加维持液，在37℃培养箱中培养。

流程四：细胞病变的观察

逐日在低倍显微镜下检查CPE。细胞在接种病毒后，24～48h开始出现病变，72～96h约达到80%病变。病变现象：细胞空泡化、圆缩，先灶状脱落，再大片脱落，最后整个细胞裂解、破碎。图3-2所示为PRRSV感染后，出现CPE的Marc145细胞。

流程五：病毒收获

CPE出现在接种病毒后的48h，72～96hCPE达80%左右，当细胞出现80%以上CPE时，即可开始收获病毒。反复传过几代后病变时间可缩短。收获病毒后，-20℃冻熔3次，混匀病毒悬液，96孔板测定TCID₅₀。

图3-2　PRRSV感染Marc145细胞后得到的细胞病变图片

（a）长成单层的Marc145细胞；（b）、（c）、（d）PRRSV感染后，出现CPE的Marc145细胞

收液时需要将含毒细胞反复冻熔2～3次以破碎细胞，将病毒释放到培养液中。

四、工作注意事项

（1）分离病毒时应选择易感细胞。

（2）病毒与细胞的选择方法：禽类的病毒一般选用鸡胚成纤维细胞；PRRSV选用Marc145细胞；PRV选用PK15细胞；FPV选用FK81细胞；CDV选用Vero细胞或MDCK细胞；CAV可选用MDCK细胞；

（3）上述为大多数病毒的常规接种方法。有些病毒（如细小病毒）需要在分裂旺盛的细胞中才能生长，这时病毒接种应在细胞贴壁后不久进行，甚至在细胞分装时接种。还有一些细胞结合性病毒如马立克氏病病毒等，接种的病料必须是完整的感染细胞而非上清液，接种后细胞单层不能用Hank′s液将感染细胞洗去。

五、思考题

（1）在进行细胞培养前，如何处理被接种的病毒性材料？

（2）利用细胞培养病毒时，如何进行病毒接种？

（3）常见的细胞病变有哪些？