酶联免疫吸附法检测乙型肝炎病毒表面抗原

酶联免疫吸附法检测乙型肝炎病毒表面抗原_生物化学实验技术

实验项目三　酶联免疫吸附法检测乙型肝炎病毒表面抗原

学习目标

【知识目标】

（1）能够迅速而准确地陈述酶联免疫吸附法检测乙型肝炎病毒表面抗原的操作要点。

（2）能用自己的语言描述酶联免疫吸附法检测乙型肝炎病毒表面抗原的原理。

（3）能够准确鉴别乙型肝炎病毒表面抗原检测的结果，并能说明其临床意义。

【能力目标】

（1）能在规定时间内正确完成乙型肝炎病毒表面抗原检测的各步操作内容，做到步骤正确、动作连贯协调、内容全面无遗漏。

（2）能熟练使用酶标仪、洗板机、微量加样器。

（3）能够理解乙型肝炎疫苗有效成分是乙型肝炎病毒表面抗原的原因。

（4）能够熟练说出乙型肝炎的五项检测指标，准确判断“小三阳”及“大三阳”。

案例引导

患者，男，30岁，近期经常感觉右肋下不适、隐隐作痛，全身倦怠、乏力，食欲减退，感到恶心、厌油，食用油腻食品后出现腹泻。有时感觉低热。检查结果显示：肝功能检查中谷丙转氨酶（ALT）为56U/L（正常值0～40U/L）；乙型肝炎五项检查中HBsAg（＋），HBsAb（－），HBeAg（＋），HBeAb（－），HBcAb（＋），其他肝炎病毒血清指标未见异常。请结合患者症状及检查结果作出初步诊断。

（提示：急性乙型肝炎）

【实验原理】

酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是在免疫酶技术基础上发展起来的一种免疫技术。

ELISA法的基本原理如下：使抗体（抗原）结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性，称为包被。再使抗体（抗原）与某种酶结合成酶标抗体（抗原），这种酶标抗体（抗原）既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在检测时，将受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗体（抗原）按不同的步骤与固相载体表面的抗体（抗原）发生反应，生成抗体（抗原）－待测抗原（抗体）－酶标记抗体（抗原）复合物，最后再与该酶的底物反应生成有色产物。待测抗原（抗体）的量与有色产物呈正比，故可根据颜色反应的产物颜色深浅进行定性分析，也可借助于光吸收率来计算抗原（抗体）的量进行定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。在上述过程中，酶促反应只进行一次，而抗原抗体免疫反应可进行一次或数次。因此，实验时可根据需要自行设计进行二抗、三抗的免疫反应。

酶结合物是酶与抗体或抗原在交联剂作用下联合的产物，是ELISA成败的关键试剂。它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，因而显示出生物放大作用。制备酶结合物必须符合高纯度、高活性、高单价3个条件。其中的酶应具有性能稳定、经济易得、底物无色、产物显色、便于检测的特点。常用的酶有碱性磷酸酯酶、辣根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等。它们均可催化相应的无色底物，产生有色产物，并有特定的光吸收峰。终止酶促反应后，底物不再改变。

按非均相酶免疫测定法可将ELISA分为多种类型，但常用的有直接法、间接法、双抗体夹心法、双抗原夹心法等。

乙型肝炎病毒（HBV）为一种DNA病毒，外形似一个大球状颗粒，其外层是由病毒蛋白组成的双层外壳，内部是一个含DNA分子的核心。在HBV外壳与核衣壳构成的囊膜之间存在乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg），在核衣壳与核心间存在乙型肝炎核心抗原（HBcAg）和乙型肝炎e抗原（HBeAg）。当HBV侵染肝脏细胞后，HBsAg会刺激机体产生HBsAb，HBsAb是机体感染HBV的一种血清学标志。HBV在肝细胞浆内复制病毒的外壳，并且复制的量比在肝细胞核内复制的核心多，过剩的外壳释放入血液中，在血清检测时可检测到外壳中的HBsAg；HBcAg会刺激机体产生HBcAb，HBcAb是HBV复制及机体血清具有传染性的一种标志，但HBcAg用来组装病毒很少在血清中被检测到；HBeAg刺激机体产生HBeAb，但HBeAg的本质目前还不十分清楚。

本实验采用双抗体夹心法检测HBsAg。其测定原理是先将过量抗体包被于固相载体表面，加入待测抗原，同时加入多克隆抗－HBs－HRP（酶标抗体）。当标本中存在HBsAg时，可进行抗原抗体特异性结合反应，生成抗体－待测抗原－酶标抗体复合物，即双抗体夹心法（图3－6）。最后加入该酶的底物（TMB）发生显色反应，生成有色产物，根据颜色反应的深度进行抗原的定性检测。反之，则无显色反应。也可进一步进行定量分析，终止反应，测定有色产物的吸光度，计算待测抗原的量。

图3－6　双抗体夹心法原理示意图

主要反应过程如下。

HBsAb（固相载体吸附）＋HBsA─→g固相免疫复合物

免疫复合物＋酶结合物（酶标记HBsAb）─→双夹心复合物

双夹心复合物＋─→酶底物有色产物

【实验器材】

预包被聚苯乙烯微量反应板（48孔或96孔），可调式微量吸液器（200μL），封口膜，37℃恒温箱，酶标仪，洗板机（或洗瓶）。

【药品及试剂】

酶联试剂，HBsAg阳性对照，HBsAg阴性对照，PBST洗涤液，显色剂A（Color A），显色剂B（Color B），终止液（2mol/L H₂SO₄），血清。

【试剂配制】

用蒸馏水或去离子水对浓缩液进行20倍稀释即得PBST洗涤液。

其余为相应试剂盒提供。

操作流程

【操作步骤】

1.编号

本实验在预包被好HBsAb的聚苯乙烯微量反应板中进行。（聚苯乙烯微量反应板：96孔和48孔两种规格；含有可拆换聚苯乙烯微孔条，每条含有12个加样孔，每个孔都预包被了HBsAb）将微孔条固定在支架上，并将各孔编号（1为空白对照孔，2为阳性对照孔，3为阴性对照孔，从4孔开始作为样本检测孔，每人作一个待测样本）。

2.加样

分别在相应微孔中加入空白对照（正常血清）、阳性对照、阴性对照、待测血清各50μL。

3.加酶

分别在各孔加入酶联试剂50μL（用辣根过氧化物酶HRP标记的HBsAb），混匀，用手在一个平面上左右前后振荡，注意不可用力过大，避免孔内液体振出。

4.温育

将反应板置于37℃恒温箱中60min，使抗原抗体特异性结合反应充分。

5.洗涤

用PBST洗涤液充分洗涤5次，每次均需控干。

6.显色

每孔加显色剂A、B各50μL，混匀，37℃时暗置15～20min，使固相载体上结合的双夹心复合物上的酶催化底物生成有色产物。

7.终止

每孔加终止液50μL，混匀。

8.检测

用酶标仪在450/630nm双波长下，检测各孔吸光度值。

【实验数据处理及结果分析】

1.初步判定结果

通过对检测孔颜色与阳性颜色、阴性颜色对照比较后，得出结果。

2.定量分析

用酶标仪检测双波长450/630nm，测定各孔的OD值，并计算、判断结果。

临界值＝阴性对照孔OD平均值×2.1

样品OD值/临界值≥1，为HBsAg阳性；

样品OD值/临界值＜1，为HBsAg阴性。

【注意事项】

（1）保存的血清切忌反复冻融，以免降低血清中抗体或抗原的免疫学活性。

（2）将试剂盒从冷藏环境中取出，待平衡至室温后（约30min）方可开启使用。

（3）加样时切忌振荡或相互污染。

（4）洗涤要充分，每次洗涤要控干。

（5）为使显色反应便于比较，显色后置于室温暗处的时间应一致，终止反应3～5 min后应立即比色。必要时可设阳性对照，以固定显色及终止时间。

（6）待测抗原与酶标抗体应具有相同的免疫特异性，否则无法结合。

（7）注意微量加样器的使用及如何针对不同的吸液量来选择不同量程的微量加样器。

（8）注意酶标仪的使用原理及操作方法。

【实验意义】

1.正常值

样品OD值/临界值≥1，为HBsAg阳性；

样品OD值/临界值＜1，为HBsAg阴性。

2.意义

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一种世界性疾病。发展中国家发病率高，据统计，全世界无症状乙型肝炎病毒携带者（HBsAg携带者）超过2.8亿，我国约占1.3亿。主要通过血液、母婴和性接触进行传播。

感染乙型肝炎病毒后常分为以下几种类型。①乙型肝炎病毒携带者：没有症状和体征，肝功能、肝胆脾B超等检查长期正常，乙型肝炎表面抗原阳性，不论是“大三阳”或是“小三阳”，也不论HBV－DNA阳性或阴性，均称为乙型肝炎病毒携带者，占乙型肝炎感染者的大多数。②急性乙型肝炎：病程在半年内称为急性乙型肝炎，一般发病较急，有轻重不等的症状，多数人表面抗原多在半年内消失，少数可转变成慢性乙型肝炎。③慢性乙型肝炎：病程超过半年称为慢性乙型肝炎，可有轻重不同的症状，迁延不愈，反复发作。④重型乙型肝炎：病情发展迅速，症状很重，需入院积极治疗，否则可危及生命。

乙型肝炎主要有以下临床表现：常感到乏力、体力不支，容易疲劳，打不起精神；另外，肝脏作为重要的消化器官，分泌的胆汁是食物消化所必需的。患者患病时，胆汁分泌减少，影响食物的消化和吸收，因此，乙型肝炎患者常出现食欲不振、恶心、厌油、上腹部不适、腹胀等症状。肝脏内部缺乏痛觉神经，因此，乙型肝炎一般没有剧烈的疼痛。但肝的表面有一层很薄的膜，称为肝包膜，肝包膜上有痛觉神经分布，当肝脏发炎肿大时，肝包膜紧张，痛觉神经受刺激，因而部分患者可有右上腹、右季肋部不适，隐痛感。肝脏是胆红素代谢的中枢，患乙型肝炎时，由于胆红素的摄取、结合、分泌、排泄等障碍，血液中胆红素浓度增高，所以有些乙型肝炎患者会出现不同程度的黄疸。黄疸是由于胆红素从尿液排出，使尿液颜色变深，有时还可引起巩膜、皮肤黄染。过多的胆汁酸沉积于皮肤，刺激末梢神经，引起皮肤瘙痒。有些患者还会出现一些肝外表现，如有些慢性乙型肝炎患者面色晦暗或黝黑，称为肝病面容，这可能是由于内分泌失调，皮肤色素沉着引起的。手掌大、小鱼际显著充血称为肝掌。面部、颈部、前胸和手背的皮肤上出现一簇呈放射状扩张的毛细血管称为蜘蛛痣。

乙型肝炎病毒是一种由一个囊膜和一个含有DNA分子的核衣壳组成的病毒颗粒，游离的核衣壳只能在肝细胞核内观察到。血中病毒浓度以急性肝炎潜伏期后期为最高，在疾病发生后迅速下降。病毒表面含有HBsAg。目前，已可从感染HBV患者的血清中及感染肝脏提纯的病毒核心中分离出环状双股DNA，从而确定HBV属DNA病毒，在临床实践中可以将检测血清HBV－DNA的Copy数的方法广泛用于乙型肝炎辅助诊断中，是HBV感染最直接、特异性强和灵敏性高的指标。

HBsAg作为乙型肝炎五项检查（俗称“两对半”）的第一项指标在临床中应用广泛。乙型肝炎五项包括HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb。所谓“大三阳”是指HBsAg、HBeAg和HBcAb检测均是阳性。一般认为，“大三阳”传染性相对较强，同时演变成慢性乙型肝炎的可能性也比较大。所谓“小三阳”是指HBsAg、HBeAb和HBcAb检测均是阳性。它和“大三阳”的区别是后者E抗原阳性，它通常是由“大三阳”转变而来，是人体针对E抗原产生了一定程度的免疫力。一般认为“小三阳”的传染性较小。

HBsAg阳性表明受试者受到乙型肝炎病毒感染。目前，应用ELISA法检测血清HBsAg具有很高的准确度，HBsAg阳性已作为HBV感染的诊断依据。同时，HBsAg阴性也成为献血者筛检合格的指标。

鉴于乙型肝炎的高传染性，目前尚缺乏高效的治愈方法，接种乙型肝炎疫苗是预防乙型肝炎病毒感染的最有效方法。目前，乙型肝炎疫苗的有效成分主要是HBsAg，通常采用基因工程的手段制备，大大降低了成本。乙型肝炎疫苗全程接种共3针，按照0、1、6个月程序接种。疫苗接种后，可刺激免疫系统产生保护性抗体，这种抗体存在于人的体液之中，乙型肝炎病毒一旦出现，抗体会立即作用，将其清除，阻止感染，并不会伤害肝脏，从而使人体具有预防乙型肝炎的免疫力，从而达到预防乙型肝炎感染的目的。有些人抗体产生较晚，被称为应答迟缓。对此可加注1～2针，或者重新接种疫苗，并且适当增加剂量。乙型肝炎疫苗接种后产生的抗体水平随时间逐渐下降，我国众多医学者建议免疫后3年内加强1次为好。

能力检测

一、单项选择题

1.下列关于酶联免疫吸附法的描述错误的是（　　）。

A.它是在免疫酶技术基础上发展起来的一种免疫技术

B.利用抗原与抗体间的特异性结合反应

C.可根据需要自行设计进行二抗、三抗的免疫反应

D.在某些检测中利用酶促反应的生物放大作用

E.在双抗体夹心法中可以检测半抗原

2.在受HBV感染的人体血清中不能检测到下列哪项指标？（　　）

A.HBsAg　　B.HBsAb　　C.HBrAg　　D.HBeAb　　E.HBeAg

3.下列哪项是抗乙型肝炎病毒疫苗的有效成分？（　　）

A.HBeAg　　B.HBsAb　　C.HBsAg　　D.HBcAb　　E.HBcAg

4.下列哪项指标阴性可以作为献血者筛检合格的指标之一？（　　）

A.HBeAb　　B.HBcAb　　C.HBeAg　　D.HBsAb　　E.HBsAg

5.在双抗体夹心法检测血清HBsAg过程中，下列哪步操作有酶促反应发生？（　　）

A.加酶　　B.温育　　C.洗涤　　D.显色　　E.终止