兔肝中的提取

实验项目十八　兔肝中DNA的提取

学习目标

【知识目标】

（1）能用自己的语言描述DNA提取的原理。

（2）能够迅速而准确地陈述DNA提取的实验操作要点。

【能力目标】

（1）能够正确完成各项操作内容，做到步骤正确、动作连贯协调、内容全面无遗漏。

（2）能够清楚在进行DNA提取的操作时有哪些注意事项。

案例引导

患者，女，39岁，近期出现厌油、腹胀、全身乏力、食欲减退、恶心、呕吐、肝区痛等症状。肝功能检查ALT升高。HBV－DNA定量明显升高。根据所学知识，对患者作出诊断。

（提示：乙型病毒性肝炎）

【实验原理】

脱氧核糖核蛋白在0.14mol/L NaCl中溶解度很低，而核糖核蛋白却较易溶解，故用0.14mol/L NaCl洗涤组织匀浆，可得到脱氧核糖核蛋白，再用氯仿－异戊醇除蛋白即可得到DNA。

【实验器材】

微量加样器，离心机，Eppendorf管，研钵，离心管，振荡器。

【药品及试剂】

NaCl，SDS，氯仿，异戊醇，苯酚，乙醇。

【试剂配制】

（1）0.14mol/L NaCl－0.01mol/L EDTA：称取NaCl 8.18g，乙二胺四乙酸二钠盐3.72g，加蒸馏水溶解，调pH值至7，稀释至1000mL，存放于冰箱中。

（2）250g/L SDS：称取十二烷基硫酸钠25g，溶于50%乙醇中至100mL，室温下存放。

（3）2mol/L NaCl：称取11.7g NaCl，用蒸馏水配成100mL溶液。

（4）氯仿－异戊醇：氯仿24份与异戊醇1份混合。

（5）80%酚：取苯酚80份，加蒸馏水20份，混匀后装入棕色瓶中。

（6）95%乙醇。

操作流程

【操作步骤】

1.脱氧核糖核蛋白的制备

取8mL兔肝匀浆加入10mL刻度离心管中，以3000r/min的转速离心10min；（取试管标号，加试剂）弃上清液后，沉淀中加0.15mol/L氯化钠－0.10mol/L乙二胺四乙酸二钠8mL，搅匀后以3000r/min的转速离心10min。弃上清液，即得脱氧核糖核蛋白。

2.DNA粗制品的提取

上述沉淀中加入0.15mol/L氯化钠－0.10mol/L乙二胺四乙酸二钠（终体积为4mL），搅匀后逐滴加入0.5mL 15%SDS，搅拌3～5min，至溶液黏稠且略带透明（DNA与蛋白分离）。加1.0mL 5mol/L NaCl（终浓度为1mol/L），轻搅3～5min，再加等体积氯仿－异戊醇，加塞（塞紧防漏）振荡3～5min，以3000r/min的转速离心10min，吸上清液于一支10mL的刻度离心管中，加等体积氯仿－异戊醇，加塞（塞紧防漏）振荡3～5min，以3500r/min的转速离心5min；用吸管吸取上清液置于一支10 mL的刻度离心管中，再加两倍体积的95%的乙醇进行抽提；DNA析出，弃乙醇后则得到白色DNA粗制品。

【实验数据处理及结果分析】

观察每步操作对应的实验现象并加以分析。

【注意事项】

（1）在DNA的提取操作中，若有条件应在0～4℃条件下进行。

（2）酚有腐蚀性，操作时应小心，若沾洒在皮肤上应立即用水或用70%酒精棉球擦洗。

（3）提取DNA时，须待纤维状DNA大分子充分析出后，再用玻璃棒轻轻将其缠捞出来。

能力检测

一、单项选择题

1.核酸中核苷酸之间的连接方式是（　　）。

A.2′，3′磷酸二酯键　　B.糖苷键　　C.2′，5′磷酸二酯键

D.氢键　　E.3′，5′磷酸二酯键

2.核酸对紫外线的最大吸收峰在哪一波长附近？（　　）

A.280nm　B.260nm　C.250nm　D.340nm　E.220nm

3.DNA变性是指（　　）。

A.分子中肽键断裂　　　B.多核苷酸链断聚

C.DNA分子由超螺旋→双链双螺旋　　D.互补碱基之间氢键断裂

E.DNA分子中碱基丢失