酸乳中乳酸菌的分离和乳酸菌单菌株发酵

实训37　酸乳中乳酸菌的分离和乳酸菌单菌株发酵

一、实训目的

（1）学习用稀释涂布平板法分离纯化酸乳中的乳酸菌。

（2）认识乳酸菌形态，学习利用单菌株发酵实验来评定乳酸菌最佳菌种。

二、实训原理

乳酸菌在自然界中普遍存在，繁殖快，能利用各种糖类产生能抑制不少其他菌生长的乳酸。乳酸菌代表种类有德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、乳酸链球菌、乳脂链球菌、肠膜状明串珠菌、双歧杆菌等。乳酸菌因为需要各种氨基酸、生长素及微量氧气，故培养分离时比较困难。一般琼脂培养基表面生长菌落微小，常被忽略掉，故采用西红柿酵母汁培养基或西红柿酵母吐温80乙酸盐琼脂培养基进行分离纯化。

三、实训器材

1．设备

超净工作台，高压蒸汽灭菌锅，电炉，恒温水浴锅，天平，生化培养箱。

2．仪器与用具

φ90mm培养皿，250mL锥形瓶，5mL吸管，试管，称量纸，玻璃珠，烧杯，玻璃棒，不锈钢涂布棒。

3．培养基与试剂

西红柿酵母汁琼脂培养基，马铃薯汁平板培养基，NaCl。

4．样品

市售乳酸饮品，市售酸牛奶。

四、实训步骤

1．实训准备

（1）配制西红柿酵母汁琼脂培养基100mL。

西红柿酵母汁琼脂培养基配方：西红柿汁400mL；盐液A　5mL；盐液B　5mL；葡萄糖10g；酵母膏10g；琼脂15g；水600mL；pH　6．9。

盐液A配方：K₂HPO₄25g；KH₂PO₄25g；水250mL。

盐液B配方：MgSO₄10g；NaCl　0．5g；FeSO₄0．5g；MnSO₄0．5g；水250mL。

西红柿汁：西红柿与水按1∶5比例榨汁。

此培养基于100℃间歇灭菌3次。方法是将此培养基置于阿诺氏灭菌器或蒸锅内，常压下100℃处理15～30min，以杀死其中微生物营养细胞。冷却后，置于一定温度（28～37℃）下保温过夜，使其中还可能残留的芽孢萌发成营养细胞，再以同样方法加热处理。如此反复三次，可杀灭所有微生物芽孢和营养细胞。

称取CaCO₃1g，包一包，密封，121℃高压灭菌20min。

（2）配制马铃薯汁平板培养基100mL。

马铃薯汁平板培养基配方：马铃薯200g；脱脂牛奶100mL；酵母膏5g；琼脂20g；水1000mL；pH　7．0。

先按配方计算得到各组分的量，然后将马铃薯去皮、切块和称量后，加水煮汁，煮沸约20min，多层纱布过滤，在滤液中依次加入酵母膏和琼脂，边搅拌边煮沸溶解，补足水。调节pH至7．0。脱脂牛奶与其分开灭菌，均采用121℃高压灭菌20min。在倒平板前混合。

（3）带有适量玻璃珠的90mL生理盐水1瓶，包扎，于121℃高压灭菌20min。

（4）装9mL生理盐水的试管5支，包扎，于121℃高压灭菌20min。

（5）φ90mm培养皿6个，包扎，于121℃高压灭菌20min。

（6）10mL吸管1支，1mL吸管6支，分别包扎，于121℃高压灭菌20min。

（7）不锈钢涂布棒1把，包扎，于121℃高压灭菌20min。

2．操作步骤

1）采用稀释涂布平板法分离纯化乳酸菌并鉴定

（1）将用具放入超净工作台照紫外光20～30min。

（2）将西红柿酵母汁培养基置微波炉熔化，于超净工作台内加入无菌的CaCO₃1g（占2%），以无菌操作混合均匀，倒培养皿6个，待凝固。

（3）在超净工作台中，吸取10mL酸乳置于90mL无菌生理盐水中混匀得10－1稀释度的稀释液。

分别吸取各稀释度的稀释液0．2mL置于6个平板上，用无菌涂布器依次涂布（图3－35），置于37℃培养箱倒置培养48h，筛选出乳酸菌单菌落，再划线接种于马铃薯汁平板培养基上，37℃恒温培养2～3天，观察平板上的菌落形态方面的差异，区分不同类型的乳酸菌。将分离纯化得到的乳酸菌单菌落进行革兰氏染色镜检，鉴别乳酸菌的类型。一般有以下几种类型。

图3－35　稀释分离过程图

①扁平型菌落。大小为2～3mm，边缘不整齐，很薄，近似透明状，染色镜检为杆状，革兰氏阳性菌。

②半球状隆起菌落。大小为1～2mm，隆起成半球状，高约0．5mm，边缘整齐且四周可见酪蛋白水解透明圈，染色镜检为链球状，革兰氏阳性菌。

③礼帽形突起菌落。大小为1～2mm，边缘基本整齐，菌落中央呈隆起状，四周较薄，也有酪蛋白透明圈，染色镜检为链球状，革兰氏阳性菌。

2）单菌株发酵

将市售灭菌牛奶分装于已灭菌的试管中，每管装10mL牛乳。将不同类型乳酸菌单菌落分别接入各支牛乳管中进行活化增殖，然后以10%的接种量接入另外的10mL牛乳管中，分别在37℃和45℃下恒温培养，出现凝固时即发酵完成。置于4～7℃的冰箱中24h完成酸乳的后熟。

3）感官质量评定

可通过凝乳情况、口感、香味、异味、pH、菌种的繁殖速度与保存期限等几个方面综合评价每一个单菌落发酵形成的酸乳制品。通过对每个单菌株发酵形成的酸乳制品感官质量品评，确定最佳菌种。

4）产乳酸检验

往发酵试管中分别加入10%H2SO₄1mL，再加入2%KMnO₄1mL，使乳酸转化为乙醛。取滤纸条，在含氨的AgNO₃溶液中浸湿，横搭在试管口上，将试管徐徐加热至沸腾，使乙醛挥发，如管口滤纸变黑，证明有乳酸生成。

五、结果记录

（1）用彩图或彩照记录并说明平板上分离得到的不同类型乳酸菌的菌落形态和镜检结果。

（2）通过单菌株发酵实验、感官质量评定和乳酸检验结果评价不同类型的乳酸菌。

（3）总结并说明得到了几种类型的乳酸菌。

六、思考题

（1）写出乳酸菌单菌株发酵产乳酸检验的化学方程式。

（2）用筛选出来的菌种或其他市售益生菌设计一个生活中最佳菌种配比的酸乳制品制作方案。