植物化学成分的预试验

第一节　植物化学成分的预试验

植物化学成分复杂、种类很多，在着手研究植物的活性成分时，首先要大致知道该植物含有哪些类型的化学成分，便于进一步选用适当的方法进行提取分离。这就需要有一些比较简单的各类化学成分的定性预试验方法。在分离活性成分前，可先用几种不同极性的溶剂分别进行提取，进行生物活性筛选，确定哪一个溶剂提取部位有效后，再对该部位进行各类化学成分的预试验，这样可以缩小预试验的范围。另外，植物化学研究工作中，特别在植物资源化学研究工作中，需要定向地寻找某类化学成分，这就要进行某类化学成分的单项预试验。例如，为寻找具有毒性的生物碱成分，就要建立简便的预试验方法。

在做预试验之前，应了解植物的产地、生物学特性和分类学鉴定，以及借助外观、色、嗅、味等对植物样品所含成分作初步观察，以提供进一步检查的参考。如植物组织的断切面呈橙黄、棕黄色，预料可能有羟基蒽醌类衍生物；如有白色粉屑出现，可能有淀粉、糖存在；如果断面有油点，并有特殊香气，则考虑除油脂外，还可能有芳香油、香豆素、内酯和某些挥发性成分存在；如味苦，可能有生物碱、苷类、苦味质存在；如有收敛性涩味，可能有鞣质；如有甜味，可能含糖类、苷类；如味酸，且带凉爽感觉，可能含有柠檬酸、苹果酸等羟基酸；若酸带愉快的感觉，可能含有谷氨酸、丁氨二酸以及甜菜碱等。

预试验要求简便而快速，并且要有尽可能的正确性，一般是试管试验。由于植物提取液大多数颜色较深，颜色变化在试管内观察有困难，可采用纸片法，把样品和试剂点在滤纸上，让它们在纸上起化学反应，观察其颜色变化。如这样进行还难以肯定，可进一步采用纸色谱及薄层色谱的方法，把各类成分初步分开后喷洒各类显色剂，再加以判断，灵敏度也可以相应提高。薄层色谱比纸色谱展开的时间短，操作方便，更适用于预试验工作。

由于各种定性试剂都有例外情况，加上植物中所含成分的复杂性和相互干扰，根据预试验的结果立即肯定或否定某种成分的存在与否是不全面的。例如用以检查生物碱的碘化铋钾（dragendorff）试剂，对香豆素和萜类内酯等中性化合物也能发生反应。不过碘化铋钾试剂对生物碱比较敏感，当试剂与被试溶液相遇时立即产生橘红色沉淀，而对中性内酯化合物反应则较慢，须放置片刻才有红色沉淀出现。当植物中中性内酯化合物含量较高时，就难以用时间区别，在这种情况下容易把内酯化合物误认为生物碱。咖啡碱虽是生物碱，但对碘化铋钾试剂和碘化汞钾试剂均呈阴性反应。另外，植物中的酸性成分往往与植物体内的钾、钠、钙、镁结合成盐存在，不能由于水和乙醇提取液不是酸性而否定酸性成分的存在。

植物内各种成分的含量较低，尤其有些生理活性物质含量极低。如美登素在原植物中仅含2×10－7，运用一般预试验的方法是很难发现的。同时，在植物活性成分的研究工作中，还会发现一些新类型的化学成分，靠预试验方法是无法预检的。因此，要完全肯定或否定某类化学成分，往往需要做进一步的化学试验工作。

植物化学成分的预试验主要分为两类。一是单向预试法，即根据需要有目的地检查某类成分。例如，某一植物中是否含有生物碱，可以对其浸提液进行生物碱的定性反应或色谱法检验。另一类是系统预试法，即对植物中的各类成分进行比较全面的定性检查。

单项预试验通常用植物材料的水提取液、醇提取液和石油醚提取液来进行某类成分的检验。水提取液用于检查氨基酸、多肽、蛋白质、糖、多糖、皂苷、苷类、鞣质、有机酸及水溶性生物碱；醇提取液用于检查黄酮、蒽醌、香豆素、萜类、甾体；酸性醇提取液用于检查生物碱；石油醚提取液用于检查挥发油、萜类、甾体及脂肪等。

系统预试法常用递增极性的方法，即依次用石油醚、乙醚、乙醇和水等溶剂进行提取，使之分为若干部分。亲脂性强的成分（如油脂、挥发油、甾醇等）溶于石油醚中而被提取出；乙醚溶液中则可能含有内酯、黄酮、醌和弱碱性生物碱等亲脂性成分；乙醇可提取出苷类、生物碱、氨基酸、酚酸、鞣质等亲脂性弱的成分；水溶性成分（蛋白质、氨基酸等）则能溶于水中而被提取出来。也可首先选用甲醇、丙酮等弱亲脂性溶剂提出绝大多数成分，残渣用酸性水溶液温浸提出多糖、蛋白质等。所得总提物的酸性水溶液用乙醚－氯仿混合提取，可得到酸性与中性成分。碱性成分则留在酸性水溶液中不被提出。然后，再依据酸性成分能溶于碳酸钠水溶液的性质与中性成分分离。酸液碱化后再用氯仿提取，可得碱性成分。挥发油成分可通过水蒸馏而得以与非挥发性成分分离。

某些成分可采用试管法的颜色及沉淀的反应来进行判断。如还原糖、多糖、苷类，用费林试剂（碱式酒石酸铜），如生成红色氧化亚铜沉淀，为正反应，亦可用5%α-綦酚乙醇液，再加浓硫酸进行酚醛缩合反应，两液层界面出现紫色环为正反应。检查黄酮，用盐酸－镁粉反应，溶液呈红、紫、橙等色，为正反应。检查皂苷，泡沫试验及溶血反应阳性结果为正反应。检查甾体或三萜，乙醇提取物加入1mL冰醋酸使其溶解，再加1mL醋酐，最后滴入1滴浓硫酸，试管颜色由黄→红→紫→蓝→墨绿色变化很快，表示有甾体化合物，而三萜类化合物相应颜色变化较慢。检查蛋白质、多肽，水浸液加40%氢氧化钠溶液2滴，摇匀，再加1%硫酸铜溶液1～2滴，如显紫色、红色或紫红色，为正反应。欲确定是否含蛋白质，可用酸性蒽醌紫试剂，点样在纸片上，滴加此试剂少许（0.05%酸性蒽醌紫溶液100mL，加0.5mL硫酸），如呈紫色，表示含蛋白质，而氨基酸、多肽皆不显色。

提取液如颜色较深，不易鉴别，可用纸片斑点或滤纸展开。取直径约13cm的圆形滤纸一张，中心打一直径约4～5mm的小孔，用铅笔将滤纸划分为若干等份，并在距中心孔1cm处用“X”标记原点位置，然后用毛细管（或微量注射器）在原点分别点样品溶液（点样可以点成圆点，也可点成弧状）。在滤纸中心孔插入滤纸芯，移到盛有展开剂的培养皿（直径12cm）上，滤纸芯浸入展开剂，上盖一个同样大小的培养皿。待溶剂前沿达滤纸边缘时，取下滤纸立即标记溶剂前沿。通常展开剂可选用正丁醇－醋酸－水（4∶1∶5）或95%乙醇。生物碱常选用氯仿－甲醇（24∶1），黄酮类化合物常选用15%乙酸，皂苷、强心苷、氨基酸多选用正丁醇－乙酸－水（4∶1∶1）。极性小的其他成分可选用苯－无水乙醇（4∶1）。溶剂干后沿铅笔划分的等分线剪开滤纸，分别用显色剂喷雾显色，自然晾干或加热后观察有无色斑。

检查生物碱，用碘化铋钾试剂显色，如呈橘红色斑点为正反应；检查酚性成分，用2% FeCl3乙醇液与2%铁氰化钾水溶液，临用时等量混合喷雾显色，如呈蓝色斑点为正反应；检查有机酸可用0.1%溴酚蓝试剂，如在蓝色背景上显黄色斑点为正反应；检查甾醇、甾体皂苷、三萜皂苷用新鲜配制的5%磷钼酸乙醇液喷雾，并于120℃烘至显色，如显蓝色－蓝紫色斑点为正反应；检查内酯、香豆素类可用异羟肟酸铁喷洒，如呈蓝色－紫色斑点为正反应；检查黄酮类成分，用1%AlCl3乙醇液、氨蒸气熏、3%FeCl3或1%Mg（Ac）2甲醇溶液显色均可使斑点颜色加深和荧光增强，为正反应；检查蒽醌类，喷5%KOH试剂呈红色为正反应；检查强心苷先喷2%3，5-二硝基苯甲酸乙醇液，再喷4%NaOH乙醇液，如显紫红色斑点为正反应；检查氨基酸，用0.2%茚三酮醇溶液喷匀后在80～95℃下烘干10min，如呈红色、蓝色或紫色斑点为正反应；检查挥发油，首先观察样品点在纸上加热后油斑是否消失，不消失为脂肪油，消失为挥发油，也可结合薄层板上喷雾1%香草醛浓硫酸试剂，加热后出现各种鲜艳的斑点来确认。薄层色谱条件：硅胶为吸附剂，石油醚或石油醚－乙酸乙酯（17∶3），苯或苯－乙酸乙酯（9∶1）为展开剂。