方法学简介

一、方法学简介

定量测定的方法很多，中药分析中常用的有分光光度法、薄层扫描法、气相色谱法、高效液相色谱法等。

（一）分光光度法（spectrophotometry）

分光光度法包括可见紫外分光光度法和红外分光光度法两种，其理论基础是朗伯—比尔定律。对于中药的各种有效成分或主成分，其本身有色，或与一定显色试剂作用后可形成有色物质，或在紫外或红外区有吸收，而且在一定范围内，其溶液的吸收度与浓度的关系符合朗伯—比尔定律的，均可用此法分析。生物碱、醌类和黄酮类化合物常用此法，如石斛总生物碱的测定、黄柏中小檗碱的测定、决明子中蒽醌化合物和紫草中紫草素类化合物的测定、葛根中总黄酮的含量测定等（王强，1996）。

（二）薄层扫描法（TLCscanning）

1.测定原理

薄层扫描法（TLCscanning）又称薄层光密度法（TLCden.sitometry），是在薄层色谱的基础上，通过薄层扫描仪直接测定薄层板上色谱斑点的吸光度（透射光强度或反射光强度）的定量方法。它利用薄层扫描仪对薄层板上的斑点直接扫描，透射光或反射光被光电倍增管接受，放大并转换为电信号后被记录器记录下来呈现出一个个峰。当一定波长的光照射在薄层上无斑点的部位时，由于对光没有吸收，记录纸上画出基线是平的；扫描至斑点部位时，由于斑点对光有了吸收，在记录纸上呈现出一个峰。数据处理机会自动记录峰面积（或峰高）的积分值。在一定浓度范围内，峰面积（或峰高）值与浓度呈线性关系，符合朗伯—比耳定律，以此可以计算出斑点中化合物的量。该方法简便快速，测定结果较准确、灵敏（可测定μg或ng级样品）。

2.影响扫描测定结果的条件

用仪器对斑点直接进行测量，尤其是近几年采用的双波长扫描仪减少了因薄层不均匀带来的误差，大大提高了薄层色谱定量的准确度和自动化程度。但由于实验过程中许多因素，如点样技术、薄层板质量等都会直接影响扫描测定的结果，因此，薄层扫描中符合朗伯—比耳定律的浓度范围一般较窄。

（1）吸附剂的性能和薄层板的质量：吸附剂的大小、孔径分布均匀性都会直接影响样品分离度和检测灵敏度，一般常用的硅胶直径为10～40μm，另外铺板技术及板的厚度也是影响测定结果的重要因素。铺板均匀，分离效果好，重现性好，斑点整齐，有利于定量分析。药典规定薄层厚度为0.1～0.3mm，若厚度太薄，则斑点容易发生扩散，当用透射法测定时，峰面积会偏小；用反射法测定时，峰面积会偏大。薄层板暴露在空气中，可导致pH值改变，水分增加，使性能变化。活化后的薄层板应保存在干燥器中，若放置时间较长，再用时应先活化。为了使薄层色谱的重现性好，扫描结果稳定可靠，薄层板制作规范化甚为重要。

（2）点样方法：点样要准确，一般用微量注射器点样，原点大小要控制一致，点样量不宜过多。点样方式则可根据样品情况而定，有的点成圆点分离效果好，有的点成条状分离效果较好。点样量要固定，不宜多次重复点样，否则原点样品过浓，展开溶媒往往从原点的周围通过，较难渗透内部，会造成斑点形状不规则。

（3）层析条件：展开剂最好为单一溶剂，若需用混合溶剂则配比要固定，这样才能保证层析后斑点集中、规则、对称、分离效果好。被测物的Rf值一般要求在0.25～0.75之间，因为同样量的样品展距越长，斑点就越大，积分值就越大，直接影响测定结果，故应特别注意。应尽量防止边缘效应，由于边缘效应，会造成点在薄板中部的斑点比点在两边缘处的Rf值小，峰面积会有差异，因此应尽可能使层析缸中展开剂蒸气饱和。

（4）显色方法：紫外区有吸收或可见光下有色的斑点无需显色，若必需显色，要求显色后背景色很浅，背景与斑点颜色应反差较大，斑点颜色的深度与样品量成正比关系，重现性好；显色剂雾滴应小而分布均匀，且不宜喷量过多，并应选择最佳显色时间及最佳放置时间；样品与对照品应在同一板上显色。

（5）误差来源：误差来源于仪器本身误差、仪器操作误差以及异板误差等，一般上述误差可达5%左右（变异系数）。

（三）气相色谱法（gaschromatography，GC）

1.基本原理

当一种不与被分析物质发生化学反应的被称为载气流动相的永久性气体（如H2、N2、He、Ar、CO2等）携带样品中的若干组分，通过装有固定相的色谱柱时，由于各组分分子与固定相分子间发生吸附或溶解或离子交换等物理化学过程，使那些性能结构相近的组分由于各自的分子在两相间反复多次分配发生很大的分离效果，从而使混合样品中的各组分得到完全分离。

气相色谱（GC）的优点是快速、选择性好、灵敏度高、分离效能高。

气相色谱的主要缺点为受样品蒸气压限制和鉴定较困难。

2.定量分析误差

在气相色谱中，误差主要来自取样、样品在色谱仪里的吸附或分解、检测器、记录器等几方面。

（1）取样技术：误差来源于两个方面，一是取样的代表性、准确度与精度；二是所取样品是否能确保真正进入气相色谱仪，即从取样到样品进入气相色谱仪这段时间内，样品是否发生分解、蒸发或发生某些化学反应而产生了变化。若在这其中样品发生任何变化，都会直接影响峰面积。

（2）样品的吸附或分解：有的化合物在分析过程中可能在进样口、色谱柱或检测器里一部分被吸附或分解，这样就使得注射进去的样品不能完全形成相应的吸收峰，从而造成计算上的误差。

（3）检测器的性能：每一种检测器对不同的化合物有不同的响应，如操作条件变化则检测器的响应也要变化，在作校正曲线时应予注意。

（4）记录器：记录器是一种机械电器装置，和其他仪器一样，也会产生系统误差。使用时必须校正线性、量程、记录笔速和电器零点，才能保证定量结果准确。

3.计算方法

（1）外标法（绝对检量线法）：配制一系列已知浓度的标准液，在同一条件，同量注入色谱柱，测量其峰面积（或峰高），作出峰面积（或峰高）与浓度的标准曲线。然后同条件下，注入同量样品，测量其峰面积（或峰高），根据标准曲线，计算样品中该成分的浓度。此法简单，但要进样量准确，适用于气样分析。

（2）归一法：测量每一个峰的面积，单个峰面积除以峰的总面积，就得到组分的百分数A：

A＝（A的面积／总面积）×100%

这是一种简便的定量方法，但要求样品中所有组分都要产生色谱峰。

（3）内标法：准确称取样品，加入一定量纯物质作为内标物，然后进行气相色谱分析，根据试样和内标物的质量比和相应的峰面积比，求出某组分的含量。

因为：

W_i／W_s＝（f_i·A_i）／（f_s·A_s），Wi＝（W_s·f_i·A_i）／（f_s·A_s）

故： i＝W_i／W_m×100%＝［（W_s·f_i）·A_i／（W_m·f_s·A_s）］×100%

式中：W_s、W_m为内标物和样品质量；Wi为组分i的质量。

此法要求选择一个适宜的内标物，此内标物在样品中不存在，与样品各组分可完全分离；其峰与被测组分的峰靠近，而且内标物的量与被测组分的量接近。

（4）追加法：无适宜的内标物时，可取一定量的样品作一色谱图，再于同量样品中准确加入一定量待测组分的纯品，再作一色谱图。测量峰面积，两次峰面积之差即为追加的纯品峰面积，再按内标法同样计算。

（四）高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography，HPLC）

经典色谱法及气相色谱法虽然足以分析很多化学成分，但因为化合物具有不稳定性及难挥发性，有效成分中大约只有20%适用于气相色谱法（无需衍生化），其余80%的成分却无法分析，尤其是一些组成复杂极性大的组分。因此，中药分析需要更灵敏、更具有选择性的方法。在这种情况下，引入了高效液相色谱法（HPLC），它是一液体为流动相的色谱。

1.基本原理

高效液相色谱是目前应用最多的色谱分析方法。高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。HPLC的输液泵要求输液量恒定平稳；进样系统要求进样便利切换严密；由于液体流动相黏度远远高于气体，为了减低柱压高效液相色谱的色谱柱一般比较粗，长度也远小于气相色谱柱。HPLC应用非常广泛，几乎遍及定量定性分析的各个领域。HPLC的基本组成相像GC，不同之处在于流动相是液体而非气体。

2.检测器类型

检测器是液相色谱仪的三大关键部件之一。它的作用是将色谱柱中流出的样品组分含量随时间的变化连续地转变成易于测量的电信号，以便在记录仪上记录下来，得到样品组分分离的色谱图。目前，液相色谱中使用最广泛的检测器是紫外检测器，其次是示差折光检测器。另外，近几年发展起来的蒸发激光光散射检测器也逐渐被广泛地应用于测定无紫外吸收的成分的含量。

（1）示差检测器：示差检测器是一种通用型检测器，它是通过连续地测定流出液的折光指数变化来测定样品浓度。由于它测定的是任何液体都存在的物理量，所以适用范围很广。但因为它对溶剂本身也有响应，因此易受温度变化、流量波动等因素的影响，产生较大的噪音和漂移，灵敏度低，不适用于痕量分析，并且不能用于梯度洗脱。

（2）紫外吸收检测器：紫外吸收检测器是一种选择型检测器，是高效液相色谱最广泛使用的检测器，几乎所有的液相色谱装置都配有紫外检测器。它属于溶质性质检测器，只能用于检测有紫外吸收的物质，要选用无紫外吸收的溶剂。其工作原理基于朗伯—比耳定律。紫外检测器结构简单，使用方便；灵敏度较高，可检测纳克级物质；对流速和温度的变化不敏感，适用于梯度洗脱；线性范围宽，约105；不破坏样品，可用于制备色谱。在各种检测器中，其使用率占70%左右，对占物质总数约80%的有紫外吸收的物质均有响应。

使用紫外检测器时，溶剂不应吸收测定波长的紫外光，样品测定波长应当在溶剂紫外吸收波长上限以上，才能保证检测灵敏度。当溶剂含有吸收紫外光的杂质时会使检测背景提高，灵敏度降低；用作梯度洗脱时，会引起信号严重漂移。所以，必要时使用分光纯溶剂，或对溶剂进行专门的纯化处理。

（3）蒸发激光光散射检测器：这也是一种通用检测器，其检测基于以下原理：洗脱液由热气流使之热气化喷雾，再进入加热管，溶剂在此挥发，从而在载气流中留下待分析检测的物质颗粒；这些颗粒通过一激光束，使光发生散射，散射光由光电倍增管收集检测。其响应的大小与通过检测器的被分析质粒的数量和大小有关（郭玉宁等，2000）。

影响光散射检测器检测性能的基本因素：

①漂移管温度对基线噪音的影响：温度对基线水平和噪音的影响并没有明显的规律。低于某一温度时，流动相得不到充分的挥发，基线水平就较高，但并不是温度越高越好，因为高温可能会带来更大的噪音。最优温度应该是在流动相（包括其中所含的盐）基本挥发的基础上，产生可接受噪音的最低温度。

②气体流速对响应值的影响：气体流速越大，漂移颗粒越小，散射光越弱，从而响应值越小。最优气体流速应是在可接受噪音的基础上，产生最大响应值的最低气体流速。

③盐对基线噪音的影响：绝大多数酸碱性化合物的检测都需要缓冲液，缓冲液中盐的挥发性与纯度对基线影响较大，如磷酸盐难以挥发，就会得到较高的基线水平和较大的基线漂移。

④响应值与浓度的关系：响应值与浓度的关系并不成简单的线性关系，而是峰面积和峰高的自然对数分别与浓度的自然对数有较好的线性关系（冯埃生等，1996）。

由于蒸发光散射检测器为质量型通用检测器，不受被检测成分有无紫外吸收限制，所以已被广泛应用于一些无紫外吸收植物成分的检测，如倍半萜内酯（田南卉等，1997）、皂苷（ParkMK，1996；李会军等，2000）、生物碱（朱丹妮等，2000）等。另外，蒸发光散射检量测器也被成功地应用于不挥发性成分，如糖类、脂类及表面活性剂的分析（冯埃生等，1996）。

3.定量分析误差

液相色谱定量总是通过被测组分峰的峰高或峰面积的测量进行的，故分析的准确度和重复性受到影响峰面积的许多相关因素的影响。

（1）样品的准备：试样是影响定量结果的重要因素之一。在样品的准备过程中，造成误差的原因主要有：取样不具代表性，配制样品的溶剂选择不合适，贮藏样品不当及样品预处理不合理等。因此，首先取样应当具有代表性，其次配制样品的溶剂除了要能使样品完全溶解，溶液透明外，还要与流动相互溶，不能与流动相和固定相发生反应。一般分析溶液都具有挥发性，保存不当则浓度会发生变化。最后试样的预处理也相当重要，有时要进行化学衍生反应。

（2）进样技术：进样引起的误差主要是由于不能准确地重复进样量和由于进样技术不佳而引起的峰扩展。

（3）色谱分离：色谱柱和流动相的稳定性皆能影响定量结果。在定量分析中，选用物理强度好、色谱性能稳定的固定相是有利的。重要的是在校正和分析过程中，固定相、流动相和溶质之间的平衡能严格一致。为此，常采用预柱保护色谱柱。流动相流速或组成的变化总要使洗脱峰的面积或高度发生变化，从而影响分析结果。精确的定量分析要求严格控制流动相的流量和组成。

（4）检测器的特性：首先应根据待测组分的性质选择合适的检测器，另外，进样量决不可以超出所用检测器的线性范围。

（5）分离度：分离度大小直接影响峰高和峰面积测量的准确度。

4.计算方法

气相色谱的定量计算方法一般认为都可用于高效液相色谱，常用的方法有：外标法、内标法、内部归一化法及内加法。