联合作用的研究方法

二、联合作用的研究方法

迄今为止研究外源化合物联合作用的方法都是以急性试验为前提，不论在药理学研究药物配伍，还是在毒理学均如此。但是人们经常是长期或持续接触外源化合物，至于慢性联合作用的研究方法尚待探讨。即使以急性试验为基础的研究方法，也很不完善，学者们还在探讨研究之中。

1.联合作用系数法

此方法的系数K，是在求出参加联合作用的各化合物各自的LD₅₀值之后，从各化合物的联合作用是相加作用的假设出发，计算出混合化合物的预期LD₅₀值。根据实际测出的混合物LD₅₀值，求出预期LD₅₀与实测LD₅₀的比值，即预期LD₅₀／实测LD₅₀之比值就是系数K。

计算预期LD的公式为：

式中，a，b，……n——A，B，……N为各受试物在混合物中所占的质量比例，a＋b＋……＋n＝1。

如果参加试验的各化合物在一定剂量配比下为相加作用，则实测LD₅₀值与预期LD₅₀值应相等，此时K＝1。但是由于通常重复测定LD₅₀时会有2～3倍的波动，所以相加作用时K值应在1左右，允许一定的波动。为此，提出了两种评定联合作用的类型的K值范围（表3-11）。

表3-11　K值评定联合作用类型表

但是对于系数K法的科学可靠性，学者们持不同观点。有些人认为此法不确切，主要认为系数K法求预期混合LD₅₀值的含义是将各受试化合物（A、B、……N）各自的LD₅₀值的若干分之一相加，但A、B、……N各自LD₅₀值的若干分之一是不同质的，不能相加，而且任何一个化合物的LD₅₀的若干分之一只能表示为LD₅₀剂量数的几分之一，即是剂量单位，而决不是LD₅₀的几分之一，即死亡率单位。从动物死亡率与化合物剂量——反应曲线的斜率可见，动物死亡25%（LD25）所需的化合物剂量不一定就是0.5LD₅₀剂量。

2.等效应线图法

此法只能评定两个化合物的联合作用。其原理是在试验条件和接触途径相同的情况下，分别求出受试的甲、乙两个化合物的LD₅₀值及95%可信限。用坐标纸绘图，即以纵坐标表示甲化合物的剂量范围，以横坐标表示乙化合物的剂量范围。分别将甲与乙化合物的LD₅₀剂量及95%可信限的上、下限剂量点在各自的坐标上。再将甲、乙二化合物的LD₅₀与95%可信限的上、下限剂量点相应的相连，形成三条直线（LD₅₀线、95%可信限上限线及下限线）。此三直线的上、下限直线为界定的等效应线区。然后相同条件下取甲、乙两个化合物等毒性剂量（如各取0.5LD₅₀剂量）给动物染毒，求出新的混合LD₅₀。以混合LD₅₀值中甲化合物与乙化合物所含各自的实际剂量分别在相应的坐标图上标出，此两个剂量点均作垂直线，二垂直线延长相交。以此相交点的位置评价联合作用的类型，如果此交点正好处于等效应线区之内，即表示为相加作用；如交点落于95%可信限的下限以下，表示毒性增大，即协同作用；如交点落于95%可信限的上限以上，表示毒性减弱，即拮抗作用。

等效应线图法在求混合物LD₅₀时，是甲、乙两个化合物取等毒性剂量给动物染毒。此处的“等毒性剂量”往往以各自化合物的0.5LD₅₀表示，这就与系数K法犯有相同不妥之处。如果均取各化合物的LD25剂量染毒，则与该法含义不一致。

由于以上评价联合作用的方法有不少争议，有学者又提出了概率和法。此方法将化合物的毒性效应（死亡率）改用概率单位表示。以PA代表甲化合物的死亡率，以PB代表乙化合物的死亡率。两化合物合并染毒的预期毒性为相加作用时，以下式表示：

PA＋B＝PA＋PB－PA·PB

认为上式表达了各化合物各自发挥作用的独立事件的相加。以动物死亡50%为例，则PA＝0.5，PB＝0.5，此时PA＋B就不应等于1，而应等于0.75才是可取的。且在此基础上又提出等概率和曲线法。但是，也有学者认为不妥，主要是缺乏理论根据。

Mansour等人提出一种新的方法，判断两种药剂混合后的相互作用。具体方法是：将两种单剂分别配成一定浓度（试鼠死亡率介于30%～70%的剂量），并将两种单剂配制成混合药液（混合药液中各单剂浓度与它们单用时的浓度相同），分别测定各单剂和混剂对试鼠的毒杀效果。依照下列公式判别增效与否：

混剂理论死亡率（Pm）＝1－（1－Pa）（1－Pb）

Pa、Pb分别为各单剂的试鼠死亡率。

协同毒力指数（c.f）＝（实际死亡率－理论死亡率）／理论死亡率×100

以c.f值大小来定性评判两种药剂混用的联合作用，其中c.f≥20时为协同作用，c.f≤－20时为拮抗作用，－20＜c.f＜20时为相加作用。