柠檬酸发酵技术

柠檬酸发酵技术_生物工艺学实验指

综合实验一　柠檬酸发酵技术

一、背景知识

（一）柠檬酸的发展概况

柠檬酸（citric acid），学名2-羟基-丙烷三羧酸，是典型的有机酸，其结构式为：

图1-1-1　柠檬酸结构式

柠檬酸具有令人愉快的酸味，在水中溶解度极高，能被生物体直接吸收代谢。它本身也是化学合成的中间体，因此被广泛应用于食品、化工、医药、纺织、电子、建筑等行业。柠檬酸发酵的原料品种繁多、资源极广，可以说凡是能通过微生物代谢而产生柠檬酸的物质都能作为柠檬酸发酵的原料。

柠檬酸的生产，始自1784年Seheel从柠檬汁中提出制成了结晶柠檬酸。1891年Wehme从腐败的柑橘中分离出一种丝状真菌，它能使含碳酸钙的糖液变成酸，并分离得柠檬酸。1916年，Thom与Currie发现很多微生物能产生柠檬酸，并利用黑曲霉工业化生产柠檬酸。1923年，美国Pfizer公司以浅盘表面发酵法大量生产柠檬酸。1951年，美国Miles公司率先采用深层发酵法大规模生产柠檬酸。我国的柠檬酸工业在新中国成立前是个空白。新中国成立初期虽然也进行过一些研究，但进展缓慢。1959年，国家轻工业部发酵所首先建立了应用含柠檬酸培养基淘汰不耐酸菌株的自然选育法。1968年，该所与黑龙江和平糖厂合作，首先完成了甜菜糖蜜浅盘表面发酵并投入工业化生产。从20世纪70年代到90年代，我国一直致力于柠檬酸生产菌种的改进，柠檬酸发酵取得了举世瞩目的成就。据统计，2010年我国柠檬酸产量已达98万吨，2011年柠檬酸产量与上一年基本持平。目前，全国柠檬酸年产能占世界的70%左右，年产量占世界的65%左右，是全球最大的柠檬酸生产国。国内主要生产企业有安徽丰原集团、湖南银海石化集团、安徽阜阳制药、山东四沙股份及无锡罗氏中亚等。

我国是农业大国，生产柠檬酸的原料资源丰富，发酵指数处于世界前列。但后续的提取工艺和设备比较落后，能耗高，深度开发产品少。近年来，由于柠檬酸生产能力增长过快，市场出现供过于求。再加上技术创新滞后及国际竞争日趋激烈，导致经济效益呈现下滑趋势。

综观当前的柠檬酸发展形势，柠檬酸生产企业应从多种方向上提高自身的竞争力：

不断改进生产工艺，提高产品的质量和档次。

加快产业升级，积极开发下游产品，如柠檬酸钙、柠檬酸醋、柠檬酸铁、柠檬酸二氢铵等。

向有市场潜力的国家和地区扩展。

结合市场需求，积极研发便利型、多功能产品，如柠檬酸和营养甜味剂混合体等。

（二）柠檬酸发酵的生产原理

1940年克雷伯斯提出三羧酸循环学说以来，柠檬酸的发酵机理逐渐被人们认识。研究已经证明，糖质原料生成柠檬酸的生化过程中，由糖变成丙酮酸的过程与酒精发酵相同，即通过E-M途径（双磷酸己糖途径）进行酵解，然后丙酮酸进一步氧化脱羧生成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A和丙酮酸羧化生成的草酰乙酸缩合成为柠檬酸并进入三羧酸循环途径。柠檬酸是代谢过程的中间产物。正常的生物细胞内，一般是不会积累柠檬酸的。在发酵过程中，当微生物的乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合成酶活性很高时，才有利于柠檬酸的大量积累。

柠檬酸是生物机体TCA循环的中间代谢物之一，在许多微生物中都可以检测到。但不是所有能产柠檬酸的微生物都可以作为柠檬酸发酵的生产菌种。目前，工业生产柠檬酸几乎都是用黑曲霉作为产生菌。黑曲霉发酵柠檬酸过程中，在发酵初期，发酵液中葡萄糖含量较高，而高浓度的葡萄糖正是黑曲霉α-酮戊二酸脱氢酶合成的抑制物，这样一来TCA循环就中断了，酸度得到积累（注意此时积累的是酸度而不仅是柠檬酸），但是当酸度积累到pH≤2.0时，催化柠檬酸⇋顺乌头酸⇋异柠檬酸正逆反应的顺乌头酸水合酶失活，有利于柠檬酸积累并排出体外。

为了提高柠檬酸的产量，黑曲霉发酵柠檬酸的过程中需要掌握一定的温度及通风量等条件。一般认为，黑曲霉在28～30℃时，柠檬酸产率最高，发酵速度较快，温度过低会导致发酵时间延长；温度过高时，虽然初期产酸较快，但是菌体大量繁殖会大量消耗糖以致产酸降低，同时生成较多的草酸、葡萄糖酸。目前，我国已经培养出高温发酵的产酸菌株，可以在37℃发酵。柠檬酸发酵要求培养基中有较高的溶解氧。通风和搅拌是增加培养基内溶解氧的主要方法。随着菌体生成，发酵液中的溶解氧会逐渐降低，从而抑制了柠檬酸的合成。采用增加空气流速及搅拌速度的方法，使培养液中溶解氧达到60%饱和度对产酸有利。另外，某些氨基酸、B族维生素、生物素和金属离子（如锌离子、亚铁离子、铜离子）等也是影响菌种产酸的重要因素。

图1-1-2　柠檬酸生物合成途径

（三）柠檬酸固态发酵的生产工艺

根据培养基物理性状的不同，发酵方式分为两大类：液体发酵和固体发酵。这里着重介绍后一种方法。

固体发酵是指一类使用不溶性固体基质来培养微生物的工艺过程。既包括将固体悬浮在液体中的深层发酵，也包括在没有游离水的湿固体材料上培养微生物的工艺过程。影响固体发酵技术的关键是固态发酵反应器，迄今为止已有许多类型的固体发酵反应器问世。常用的固体发酵反应器主要有以下几种类型：浅盘式反应器、填充床反应器、转鼓式反应器、流化床反应器、盆式反应器、柱式固体反应器、贮仓式固体发酵反应器、搅拌罐式反应器、螺旋推进式反应器、传输带输送盘式反应器及塔式反应器等。目前，固体发酵罐在实验室研究中应用较为普遍。这种感应器结构简单、温度和pH值容易控制、能处理胶状和非水溶性底物、原料更换方便。

柠檬酸固体发酵以薯干淀粉或薯渣等为原料，先进行菌种扩大培养后，将菌种与原料通入发酵罐得到柠檬酸发酵液，并通过一系列提取过程得到柠檬酸。其流程图如下：

图1-1-3　柠檬酸固体发酵流程图

（四）固体发酵罐的结构原理与使用操作

1.发酵罐示意图与管路说明

该流程图中空气管路阀门标号为“AXX”，蒸汽管路阀门标号为“SXX”，冷却水管路阀门标号为“WXX”，冷凝水管路阀门标号为“VXX”，电磁阀标号为“CXX”，物料管路阀门标号为“PXX”，冷冻水管路标号为“CWX”，其他气体管路标号为“NXX”。

（1）空气及其净化

来自空压机的压缩空气经净化器（外接减压稳压器、除水、除尘、空气预过滤器）进入发酵罐空气总管，空气阀A01、空气流量计、阀A02、空气过滤器，阀A03到达加湿器内或经电磁阀C02进入发酵罐底部分布器，尾气经阀VT1排出，本管路具有计量、净化作用。

（2）蒸汽

蒸汽进夹套。蒸汽经阀S01进入夹套（上进），经阀V01排出冷凝水。蒸汽对培养基预热。

蒸汽进反应器。蒸汽经阀A02、空气过滤器、阀A03、电磁阀C02进入罐内，由排气口控制阀VT1排出。蒸汽对过滤器和空气管线消毒。

（3）自来水

自来水进夹套。当电磁阀打开时，自来水经多功能阀、阀W01进入反应器夹套（下进），由夹套（上口）、电磁阀C01排出；当电磁阀关闭时，夹套水经W02进入电加热器、循环泵、单向阀进入夹套（下口），通过夹套水的循环，将加热器的热能带入夹套，通过夹套的换热加热发酵液。

图1-1-4　固体发酵工艺流程图

自来水进排气冷凝器。自来水经阀W03进入排气冷凝器，对发酵尾气进行冷却，以尽可能减少培养基的水分蒸发。

（4）冷冻水（选配）（消毒后降温应优先采用自来水）

冷冻水经切换阀T02（关T01）进入自来水管线，经切换阀T04（关T03）返回冷冻水回路。

（5）纯氧管线（选配）

纯氧管线：纯氧进入流量计、电磁阀C03、切断A21进入空气过滤器。纯氧流量调节：开C03、A21后调节流量计的调节手柄。

（6）空气流量检测与控制

空气热质量流量计，与空气玻璃转子流量计并联安装，且在热质量流量计前后安装切断阀。热质量流量计内通道必须保持干燥无尘，因此只有在发酵过程中才开质量流量计的前后切断阀A11、A12，发酵结束后应及时关闭A11、A12。

（7）补氨水管线

氨水经电磁阀C04、切断阀A31、补料针进入发酵罐，电磁阀由控制器控制。

2.实罐灭菌操作

（1）准备工作

盖紧罐盖上各种盖帽，旋紧罐盖，压紧螺栓。

（2）培养基预热

准备工作。预先启动蒸汽发生器及空气压缩机。将控制器中的温度开关拨向“关”（向下）；开排气阀VT1，关闭其他所有阀门；温度仪不耐高温和不可水浸，消毒前必须关闭排气旁通阀VT11。

开排气阀VT1，开夹套冷凝水阀V01排夹套水，关闭其他阀门。

启动反应器搅拌电机，调转速20～30r/min。

蒸汽进夹套（固体物料可以取消本操作）。缓缓开夹套蒸汽阀S01蒸汽进夹套。待排水总口排出蒸汽时调节阀V01，控制蒸汽排出量以有少量蒸汽冒出即可。并控制夹套内压力不超过0.2MPa。当培养基预热至98℃时，进入实罐灭菌操作。当培养基温度在80～90℃时，可以适当减慢升温速度，在泵稳定区域可以杀灭大部分微生物。

（3）实罐灭菌

蒸汽进过滤器。微开过滤器上排冷凝水阀V02，开过滤器前蒸汽阀S02，微加湿器底阀排冷凝水阀V03，缓缓开切断阀A03，蒸汽经过滤器进入发酵罐，同时在湿度的Rkc仪表中，将设定值SV设为0，然后按“SET”键确认。电磁阀C02在消毒过程中始终开着，以保证空气管线消毒彻底。冷凝水阀V02、V03以有少量蒸汽排出为宜，当排气口有蒸汽排出或罐温达到100℃，2min后，关闭排气阀VT1。调节切断阀A03和蒸汽阀S02，维持过滤器前蒸汽压力为0.12～0.16MPa，同时必须保证切断阀有一定开度，不得关死。

当达到预定温度或罐压，开排气阀VT1至有少量蒸汽排出，关紧或微开夹套蒸汽阀S01，根据罐压或罐温变化的趋势，及时调整蒸汽阀S02、S03。阀门调节宜微调，应避免大幅度开关。当反应器罐压或罐温维持在预定的范围内开始计时。

保温阶段应旋松接种口盖至有少量蒸汽冒出。

（4）灭菌完成及降温

保温结束首先旋紧接种口盖。

关紧冷凝水阀V03，关紧过滤器前蒸汽阀，全开空气阀A01、A02，用空气吹过滤器，当过滤器冷凝水阀V02排尽冷凝水后就可以关闭。

关夹套蒸汽阀S01和夹套排冷凝水阀V01，开夹套进水阀W01和循环水阀W02。将温度控制开关拨向“开”，并在控制仪上设定控制温度值，温度自动控制，发酵罐进入自动降温。

在降温过程中，始终监视罐压，严禁压力到零。当温度达到工艺要求时，调节搅拌转速、空气流量、罐压。

3.发酵操作流程

（1）准备

（2）接种

摇瓶接种：调节进气量至0.2VVM，开排气阀VT1至罐压接近0（不得大于0.02MPa），预先旋松接种口，在接种口处放好火焰圈并点燃（在火焰圈中放置少量的棉花可以助燃提高火焰的高度），打开接种口，导入种子，然后旋紧接种盖，立即调高罐压。

发酵初始化：在控制器的发酵罐状态画面输入“发酵批号”，再按“就绪”或“开始”并“确认”，发酵数据才能自动保存。设定发酵过程参数及适宜的控制模式。

（3）湿度控制

关阀A03，将经灭菌消毒的补水瓶及输液管放置底座上，用硅胶管将补水瓶上的呼吸过滤器与空气经过滤器阀V02连通。

旋下加湿器补料口上闷头，用酒精棉球对补料口内橡胶塞外表面消毒，然后将针头插入并穿透密封盖，并用补料针上的螺母锁紧。

开输液管上的弹簧夹，缓缓开阀V02将无菌水压入加湿器内。关阀V02，拔出针头，盖紧补料口上闷头。

湿度控制。在控制器空气子画面上设定，F1：空气50～100（说明：这里的“空气”实际是“湿度”，单位L/min应为%），F2：控制方式为“自动”，开阀A03。当湿度低于设定值时电磁阀自动关闭，空气进入加湿器。当湿度高于设定值时，电磁阀自动打开，大量空气经电磁阀直接进入发酵罐。

开排气阀VT11，关VT01。

（4）取样

取样器：开罐盖N09口上闷头，将取样管垂直于罐盖插入罐内（建议取样时关闭搅拌器），抽出取样管，盖紧上闷头。

（5）发酵开始前设定发酵参数

（6）放料

（7）发酵结束

发酵结束必须在控制器的发酵罐状态画面按“正在发酵”并“确认”。发酵数据自动整理并保存。

（8）搅拌正反转设定

在时间比例控制器拨动数字盘设定正转时间、反转时间，拨动数字盘上端的时间单位；M—分钟，S—秒。设定完成后，打开时间比例控制器右侧的控制开关（向右开，向左关），任何一次设定后必须重新开关“控制开关”。

二、实验简介

本实验分为三部分，第一部分为柠檬酸的固态发酵，第二部分为柠檬酸的提取与纸层析，第三部分为柠檬酸的液相色谱分析。实验涵盖了目前柠檬酸发酵的主要工艺技术以及柠檬酸检测分析的基本方法，通过这三部分内容的学习和实践，可为今后从事柠檬酸的发酵生产奠定理论和实践基础。

实验1-1　柠檬酸的固体发酵

（一）实验目的

1.了解黑曲霉发酵生产柠檬酸的原理。

2.掌握固体发酵罐的发酵过程及控制方法。

3.测定黑曲霉培养过程中还原糖含量、总糖含量、pH值、总酸含量及柠檬酸含量的变化。

（二）实验原理

黑曲霉是柠檬酸发酵的主要菌种。其存在糖酵解途径（EMP）、磷酸戊糖途径（HMP）、三羧酸循环（TCA）和乙醛酸循环的酶系。黑曲霉用糖类产生柠檬酸的生物合成途径：首先，黑曲霉利用α-淀粉酶、糖化酶将薯干粉等物质中的淀粉转变为葡萄糖，葡萄糖经EMP或HMP降解，形成丙酮酸；丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰辅酶A，另一方面经二氧化糖羧化成草酰乙酸；草酰乙酸与乙酰辅酶A缩合生成柠檬酸。

（三）实验材料

1.材料

玉米粉、黑曲霉（Aspergillus niger）2333等。

2.试剂

去离子水、α–淀粉酶、CaCl2、碘液、（NH4）2SO4等。

3.主要设备

接种环、三角瓶、立式压力灭菌器、恒温培养箱、摇床、离心机、水浴锅、铁架台、显微镜、固体发酵罐等。

（四）实验方法与步骤

1.种子培养

15g玉米粉与100mL去离子水混匀，调节pH至5.5～6.0，加热并搅拌至65℃，按20U/g原料加入α–淀粉酶及1g/L CaCl2，搅拌均匀，恒温保持60min，液化15min后用0.1%碘液检测，不显蓝色或极微淡蓝色为止，即为糖化完全，四层纱布过滤于250mL三角瓶，即得糖化清液。300mL摇瓶中加入50mL糖化清液，并加入0.5%（NH4）2SO4后，121℃灭菌20min。待冷却至室温，用酒精灯烧过的接种环轻轻刮下黑曲霉孢子，接种到已冷却的种子培养基中，恒温35℃、200r/min摇床培养24h左右，即得菌液。取培养液稀释后在显微镜下计数，计算出黑曲霉菌丝球浓度，一般可达6.0×105个/mL～1.0×106个/mL。合格的菌丝球应是致密型的，菌丝短且粗，分支少，瘤状，部分膨胀。

2.发酵培养

900g玉米粉，加入6L去离子水，调节pH至5.5～6.0，加入10L发酵罐中，按20U/g原料加入α–淀粉酶及1g/L CaCl2，搅拌均匀，恒温保持30～60min，液化20min后用0.1%碘液检测，不显蓝色或极微淡蓝色为止，再加入0.5% （NH4）2SO4，封罐。蒸汽实罐灭菌后冷却至35℃，火焰法接入菌种，按接种量为10%接入罐内，400r/min，恒温35℃，通空气发酵，罐压控制在表压0.1MPa。通风量控制400～800L/h。当发酵罐酸度不再上升、3～5天后即可放罐。接种后，每24h取发酵液一次，测定菌体浓度、残糖、酸度、pH值。

3.各项指标测定方法

菌体浓度：参见附录2-12。

残糖测定：参见附录2-14。

酸度测定：参见附录2-5。

pH值测定：pH值测定方法，用发酵罐pH电极直接测定。

（五）实验结果与分析

1.做好柠檬酸发酵实验记录。

表1-1-1　柠檬酸发酵实验记录

2.思考影响黑曲霉发酵生产柠檬酸的因素有哪些。

（六）实验注意事项

1.注意pH值变化，当pH值降至2.0左右时，加入一定量的灭菌碳酸钙乳剂，使pH值回升至2.2左右时，有利于糖化作用，促进产酸。

2.需通过发酵罐控制面板了解溶解氧变化情况，调节通气和搅拌的强度（前期通风量低些对糖化有利，后期适当增加风量）促进产酸。

实验1-2　柠檬酸的提取与纸层析

（一）实验目的

1.学习柠檬酸提取方法。

2.学习柠檬酸的鉴定方法——纸层析法。

3.掌握柠檬酸含量的测定方法。

（二）实验原理

成熟的柠檬酸发酵醪中，除含有主产物柠檬酸之外，还含有纤维、菌体、有机杂酸、糖、蛋白类胶体物质、色素、矿物质及其他代谢产物等杂质，它们或来自发酵原料，或在发酵过程中产生，或溶存或悬浮于发酵醪中。要制备结晶柠檬酸必须设法除去这些杂质。

分离纯化过程主要涉及几方面：过滤除去发酵液中菌丝体，原料残渣及其他固形物质；通过理化方法除去柠檬酸以外的杂质，初步纯化柠檬酸；得到精制的柠檬酸。

提取柠檬酸的方法主要有钙盐离子交换法、液-液萃取法、全离子交换法、电渗析提取法、连续离子交换法以及色谱分离法（ILCS）。

图1-1-5　钙盐法提取柠檬酸流程图

目前，柠檬酸提取普遍采用的是钙盐离子交换法。碳酸钙可与发酵液中的柠檬酸发生中和反应，生成难溶性的柠檬酸钙沉淀，柠檬酸钙在80～90℃时溶解度极低，通过过滤或离心可将其与糖、蛋白质、其他有机酸、无机离子等可溶性杂质分开。在柠檬酸钙沉淀中加入硫酸，在80～90℃反应，生成柠檬酸和硫酸钙沉淀，硫酸钙在80℃左右时溶解度极低，趁热过滤或离心可将其与柠檬酸分开，获得较纯净的柠檬酸解液。此法总收率可达到80%～90%，且操作简单，易掌握。

纸层析法依据极性相似相溶原理，是以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶剂作为流动相。由于样品中各物质分配系数不同，因而扩散速度不同，从而达到分离的目的。试样经层析后可用比移值（Rf）表示各组成成分的位置，由于影响比移值的因素较多，因此一般采用在相同实验条件下对照物质对比以确定其异同。作为单体鉴别时，试样所显主色谱斑点的颜色（或荧光）与位置，应与对照（标准）样所显主色的谱斑点或供试品-对照品（1∶1）混合所显的主色谱斑点相同。作为质量指标（纯度）检查时，可取一定量的试样，经展开后，按各单体的规定，检视其所显杂质色谱斑点的个数或呈色（或荧光）的强度；作为含量测定时，可将色谱斑点剪下洗脱后，再用适宜的方法测定，也可用色谱扫描仪测定。

（三）实验材料

1.样品

柠檬酸固态发酵产物。

2.主要试剂

碳酸钙（CaCO3）、硫酸（H2SO4）、0.1%酚酞指示、高锰酸钾、0.1429mol/L NaOH、活性炭、展层溶剂［正丙醇∶浓氨水＝3∶2（V/V）］、0.04%溴甲酚绿乙醇等。

3.主要设备

电磁炉或水浴锅、离心机、大烧杯、蒸馏水、阳离子树脂、50mL三角瓶、双层纱布、分液漏斗、新华3号滤纸、pH计、毛细管、层析缸（30cm×60cm）等。

（四）实验方法与步骤1.发酵产物的分离

将发酵产物倒入一个大烧杯中，加入蒸馏水，搅匀，浸泡1h，用双层纱布过滤，将滤液加热至90℃处理10min，3000r/min，离心10min，除去菌体、蛋白质、酶、孢子等杂质。

2.钙盐沉淀制备柠檬酸粗品液

称取一定质量的CaCO3粉末，边搅拌边缓慢地加入剩余的清液中（每100g一水柠檬酸需要加入71.43g CaCO3，过量的CaCO3会造成胶体等其他杂质的沉淀而影响质量），此时柠檬酸呈钙盐析出。中和终点的控制可用pH法或用NaOH滴定法。若pH法以4.4～4.8为宜。中和过滤后用80～90℃的热水洗涤沉淀物以除去残糖、蛋白质等可溶性杂质。检查方法可用1%～2%高锰酸钾1滴加到洗涤水中，3min内不变色，说明糖分已洗净。

碳酸钙用量＝柠檬酸总量×0.7143

柠檬酸总量＝发酵液体积×滴定酸度×氢氧化钠浓度×0.07（柠檬酸的换算系数为0.07）

3.硫酸酸解

在沉淀物中加入约等体积的蒸馏水，搅成糊状，量取一定体积0.1M H2SO4溶液（碳酸钙的85%～90%），边搅拌边加入浆液中，80～90℃反应10min，使硫酸钙结晶成熟，3000r/min离心10min收集上层清液。

4.脱色和去除各种阳离子

用活性炭进行脱色，用阳离子树脂去除各种阳离子，当流出液pH为4时，表示有柠檬酸流出，开始收集。

5.总酸度测定

取收集的溶液1mL，加2～3滴酚酞指示剂，用0.1429mol/L NaOH进行滴定至微红色，通过计算NaOH消耗量，得出柠檬酸的百分含量（每消耗1mLNaOH为1%的酸度，酸度是100mL发酵液所含柠檬酸的克数）。

6.纸层析法鉴定柠檬酸

（1）点样

用铅笔在距新华滤纸（25cm×19cm）底端2cm左右画一直线（称为原线），线上每隔2cm画一圆点（称为原点）。然后用毛细管吸取2%柠檬酸标准液和样品液点在原点上，样品点的直径为0.3～0.5cm（位置应完全重合，以免出现斑点畸形现象）。

（2）层析

将点样好的滤纸做成圆筒状置于层析缸的展层溶液中［正丙醇∶浓氨水＝3∶2（V/V）］，展开约20～25cm后取出，挥发除尽溶剂。

（3）显色

用显色剂0.04%溴甲酚绿乙醇喷雾显色，以确定斑点位置。

（五）实验结果与分析

1.计算发酵液中柠檬酸的百分含量。

2.观察发酵产物纸层析图，计算比移值（Rf）（发酵产物与标准柠檬酸经纸层析后显色，发现发酵产物与标准柠檬酸具有基本相同的迁移率，初步说明发酵产物有柠檬酸。）

实验1-3　柠檬酸的液相色谱分析

（一）实验目的

1.掌握高效液相色谱法定量测定柠檬酸的方法。

2.了解高效液相色谱的基本原理、结构和操作方法。

（二）实验原理

高效液相色谱法（HPLC）是目前应用广泛的分离、分析、纯化有机化合物（包括能通过化学反应转变为有机化合物的无机物）的有效方法之一。在已知的有机化合物中，约有80%能用高效液相色谱法分离、分析，而且由于此法条件温和，不破坏样品，因此特别适合高沸点、难气化挥发、热稳定性差的有机化合物和生命物质。

HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部位。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。

图1-1-6　液相色谱结构示意图

HPLC法解决一个样品的分析问题时，通常必须考虑以下几个问题：

1.根据分析样品的特性选择适用于样品分析的高效液相色谱分析方法；

2.选择适用的色谱柱，确定色谱柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。

3.选择合适的分离优化条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方法。

4.由获得的色谱图进行定性或定量分析。

HPLC法测定柠檬酸通常采用反向C18色谱柱，将柠檬酸提取物中的糖、色素和有机酸分离，收集有机酸成分，以磷酸二氢钾溶液和甲醇为流动相，紫外检测器检测（紫外光谱扫描显示有机酸在214nm处有较强的吸收，故可在214nm处检测有机酸），最后结合外标法对样品中的柠檬酸进行定量分析。

（三）实验材料

1.样品

柠檬酸发酵。

2.主要试剂

甲醇为色谱纯；

水为二次重蒸水；

磷酸二氢钾溶液：称取2.72g磷酸二氢钾，用水溶解，并稀释至1000mL，用磷酸调pH值为2.9，经0.45μm微孔滤膜过滤；

氢氧化钠溶液0.01mol/L；

柠檬酸标准溶液1.0g/L：准确0.05g柠檬酸标准品用氢氧化钠溶液溶解，以纯水定容至50mL；

其他试剂均为分析纯。

3.主要设备

岛津LC-2010液相色谱仪，紫外检测器，色谱柱为Intertsil ODS-SO 4.6×150mm；预柱：Cartridge Guard Column E（10mm Column Holder），csolution色谱工作站，0.45μm微孔滤膜。

（四）实验方法与步骤

1.色谱条件

柱温：室温，流动相为甲醇0.02mmol/L，磷酸二氢钾溶液，配比为5＋95；流速为0.7mL/min；检测波长：214nm，进样量：20μL/次，保留时间定性，峰面积外标法定量。

2.样品预处理

取50mL柠檬酸发酵液离心（10000r/min，10min）除去发酵液中的固形物，然后经0.45μm微孔滤膜过滤后，吸取10mL于100mL容量瓶中，加水定容待测。

3.标准曲线的制作

准确量取柠檬酸标准溶液1g/L，用氢氧化钠溶液稀释成浓度分别为0.05g/L、0.10g/L、0.20g/L、0.4g/L、0.8g/L的标准系列溶液进液相色谱仪分析，按液相色谱分析得到的峰面积与其相应浓度制成标准曲线。

4.样品测定

取预处理后的柠檬酸发酵液按色谱条件进行液相色谱分析，根据建立的标准曲线，得到柠檬酸提取物中柠檬酸的含量。

（五）实验结果与分析

1.柠檬酸标准溶液的标准曲线。

2.柠檬酸发酵液中柠檬酸的含量。

参考文献

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（编者：严婷婷，蒋予箭）