灵芝发酵制备技术

灵芝发酵制备技术_生物工艺学实验指

综合实验二　灵芝发酵制备技术

一、背景知识

灵芝是名贵中药，古代被称作神草，历代医书中记载其具有益心气、益肺气、安神补肝、坚筋骨、利关节、治耳聋等多种功用，性温，味苦涩。近代医学研究认为，灵芝是滋补强壮、扶正固本的珍贵药物，尤其在预防衰老和老年性疾病中占有重要地位。灵芝对慢性支气管炎、冠心病、心绞痛、高山症、慢性肝炎、神经衰弱、心悸头晕等症均有不同程度的疗效，临床上还用于治疗癌症、克山病、胃病、肾病、糖尿病等病症，还兼有养生美容、延年益寿的功效，长期服用可增强人的体质，提高免疫力。

（一）灵芝的分类

灵芝是一类大型高等担子菌，隶属于担子菌门（Basidiomycotina），担子菌纲（Basidiomycetes），非褶菌目（Aphyllophorales），灵芝科（Ganodermataceae）。

我国最早从分类学角度研究灵芝的是贾祖璋和周宗璜教授，他们于1935年各发现灵芝属1种。1934至1964年，邓叔群教授从事中国大型真菌的研究，在1964年撰写了《中国的真菌》一书，记载了我国的灵芝29种，其中灵芝属19种，假芝属10种，为我国的灵芝研究奠定了基础。戴芳澜教授1987年出版的《中国真菌总汇》中，记载了中国的灵芝属26种，假芝属10种。20世纪70年代以来赵继鼎教授研究灵芝类真菌，并发表了大量新种，出版了《中国灵芝新编》等专著。

虽然我国灵芝科真菌物种丰富，但野生的灵芝资源数量有限，而且越来越少。目前分布在我国的100余种灵芝资源，只有18种被人们开发利用。它们有些被用于人工栽培，生产的子实体不仅可以满足国内市场的需求，而且还能够大量供应国外市场；有些被用于液体深层发酵，生产灵芝菌丝体及其活性代谢产物（灵芝多糖、灵芝酸等）。目前，实现商品化栽培的灵芝种类只有2～3种。《中华人民共和国药典》（2000年版）确认了灵芝的药用价值，卫生部2001年颁布的“可用于保健食品的真菌菌种名单”中，确认了灵芝的3个种，即灵芝（Ganoderma lucidum）、紫芝（G.sinense）和松杉灵芝（G.tsugae）。

（二）灵芝的形态特征

灵芝由菌丝体和子实体两部分组成。灵芝的菌丝体是其营养体。在自然条件下，它侵入腐木、朽木等适宜其生长的基质中；在人工培养条件下，则生长在培养基或培养料中。在基质表面，菌丝体会形成白色、绒毛状的菌丝层，它是由菌丝体的气生菌丝及分泌物共同组成的一种营养结构。

在生物显微镜下，可以观察到菌丝体是由许多具有分枝的菌丝密结而成。菌丝呈细管状，管壁即细胞壁，是由葡聚糖、糖蛋白、蛋白质及几丁质微丝等成分组成。在菌丝中有许多横隔，每两个横隔之间的部分为一个细胞，每个细胞中含有细胞质及细胞器、液胞等。灵芝在液体深层发酵时只有菌丝体的生长，不能形成子实体。由于菌丝体呈丝状，在深层发酵过程中，如果搅拌桨转速过快，容易将菌丝切断而影响菌丝体的生长。

灵芝的子实体分为菌盖和菌柄两部分。菌盖呈肾形、半圆形至近半圆形、扇形或近扇形，有时由几个菌盖愈合而呈近圆形；盖面呈红色至深红色或棕红色，有漆状光泽，湿时稍黏；常因其粘附大量的孢子粉，而使盖面因灰褐色粉末覆盖而失去光泽；盖面上有云纹状同心排列的环带及环沟。菌盖的断面可分为三层，表面红褐色至黑褐色，有光泽，为其皮壳，较硬；中间为菌肉，木栓质至纤维状木栓质，肉桂色，0.3～1cm以上，近皮壳层的菌肉颜色稍差；下层为子实层托，由许多菌管密集而成，菌管长约0.6～1cm，由菌盖基部向盖缘，其菌管渐短；管口圆形，每毫米间有4～5个；子实层托表面呈肉桂色，初期淡色。菌柄侧生或偏生至近中生子菌盖基部，近柱形至扁柱形，表面光滑，与盖面同色，亦具漆状光泽；内部硬栓质，与菌肉同色；菌柄与菌盖呈直角或近直角连接。

（三）灵芝的生活史

灵芝生活史简图如图1-2-1。灵芝担孢子从菌管中释放出来以后，在适宜的环境条件下，孢子开始吸水膨大并萌发，长出芽管，芽管分支伸长形成菌丝。由担孢子刚萌发形成的菌丝一般较纤细，每个细胞含有一个细胞核，故称为单核菌丝。由两条单核菌丝结合，形成双核菌丝。当其在基质中生长达到生理成熟，在外界适宜的环境条件下，菌丝体相互扭结形成一团白色的突起物，即原基。原基的顶端由无数菌丝尖端密集排列而成，这些尖端具有旺盛的分生能力，可不断地向上生长，并相互交织起来，形成菌柄。菌柄发育到一定程度，在其顶端的一侧长出一突起，并逐渐地生长展开，形成菌盖菌管。担子平行排列并垂直于菌管的内壁，每一个担子顶端发育成4个担孢子，发育成熟的担孢子从菌管中掉落下来，又开始新的生长繁殖过程。

图1-2-1　灵芝生活史简图

（四）灵芝的活性成分

由于灵芝具有特殊的药用价值，因此对灵芝有效成分的分析及其药理作用的研究受到了广泛关注，尤其是在日本、中国、韩国等国家。迄今为止，已从灵芝的子实体、菌丝体及孢子中分离获得的化合物种类繁多，包括多糖类、核苷类、呋喃类、生物碱类、氨基酸蛋白质类、三萜类、油脂类、甾醇类、有机锗等。干的灵芝子实体含灰分1%～2%、粗脂肪2%～6%、总氮6%～12%、粗纤维50%～65%、可溶性碳水化合物20%～30%、固醇类0.3%～0.4%、总酚0.08%～0.12%。

1.灵芝多糖

灵芝多糖主要指具有生理活性的单糖聚合体，具有抗肿瘤及提高机体免疫活性、抗病毒、抗衰老、清除自由基、抗血栓等作用，是灵芝具有扶正固本的主要有效成分。目前已分离到的灵芝多糖大部分为β-型葡聚糖或杂多糖，少数为α-型，多糖链由三股单糖链构成，分子量从数百到数十万。灵芝多糖大多为异多糖，单糖组成包括葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖等，单糖间糖苷键连接有（1→3），（1→4），（1→6）等，多数多糖具有分枝，部分多糖含有肽链，多糖链分枝密度高或含有肽链的其药理活性一般也比较高。根据报道，目前从灵芝中分离获得的灵芝多糖超过200种。

2.灵芝三萜类化合物

灵芝三萜类化合物具有保肝、抗肿瘤、抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性、抑制组胺释放、抑制血管紧张素转化酶、抑制胆固醇合成、抗氧化等作用，其基本构造为数个异戊烯首尾相连构成，大部分为30个碳原子，部分为27个或24个碳原子的萜类化合物。

3.灵芝蛋白类活性成分

灵芝中蛋白质类活性成分有多种类型，包括真菌免疫调节蛋白（Fungal Immunomodulatory Protein，FIPs）、凝集素（lectin）及糖蛋白（glycoprotein）等。

LingZhi-8（LZ-8）是较早报道的从灵芝菌丝体中分离获得的免疫调节蛋白，分子量约为13k Da，其蛋白质的一级结构和二级结构与免疫球蛋白重链区有极大相似性，LZ-8在生物体内以二聚体的形式存在。

4.其他活性成分

从灵芝子实体、菌丝体及其孢子中分离获得的活性化合物，还有腺苷、生物碱、有机锗、麦角甾醇、甘露醇、内脂、牛磺酸、油酸和微量元素等。灵芝中生物碱主要含有胆碱、甜菜碱、γ-三甲胺基丁酸和硫组胺酸甲基胺盐等。

（五）灵芝菌种分离

1.灵芝孢子弹射分离法

将已灭菌的琼脂培养基倾倒在培养皿内，制成平板培养基，用灭菌纱布或滤纸吸去培养皿盖内的冷凝水，备用。选菌盖肥大、形态正常的灵芝作为分离材料，在菌盖下放一张干净的白纸，6～8h，纸上出现红褐色粉状物，证明灵芝已成熟，正在释放孢子。将菌盖剪下，用75%乙醇对菌盖进行表面灭菌（切勿触及子实层的一面），将菌盖切成1cm2小块，用锋利小刀将皮壳状菌盖连同少许菌肉切去，然后在剖面涂上胶水，贴到培养皿盖内的一侧，再盖到培养皿上。将培养皿放到室温下培养，6h后，将培养皿的盖子按顺时针方向移动若干度，以后每隔4h按同样方向再移动若干度，直到回复到原来的位置。移去供分离用的组织块，用纸将培养皿包好，倒放在培养箱内培养。孢子萌发后，可形成不同密度的菌落，挑选分散性好，且又连接成片的菌落，转入试管内培养。采用此法能及时发现混入灵芝孢子内的杂菌。

2.促进灵芝孢子萌发的方法

灵芝孢子的孢壁较厚，在普通培养基上萌发速度慢，萌发率低。在3%麦芽汁培养基（pH 6.9）上，可促进灵芝孢子萌发。将采集的灵芝孢子放在含生物素的蒸馏水中，24h即可伸出芽管，72h后菌丝可形成分枝，然后挑取已萌发的孢子接种到斜面培养基上。最简单的方法是用灵芝子实体浸出液来刺激孢子萌发，最适浓度为20%，萌发率可达15%。

3.灵芝组织分离法

成熟的灵芝子实体其细胞已木栓质化，回复到营养生长的能力明显下降。因此灵芝的组织分离应选取尚未木栓质化的幼嫩组织，可以选用尚未形成菌盖的幼蕾作为分离材料，取生长前端的浅黄色幼嫩组织进行分离；生长中的灵芝，菌盖前端呈浅黄色，也可作分离材料。将切下的灵芝组织块放在0.1%汞溶液内进行表面灭菌，处理1～2min，也可用75%乙醇作表面灭菌处理。用小刀切去外部皮壳，再将组织块切成0.2cm3小块，接种到培养基上，放在28℃的黑暗条件下培养。在有光条件下，灵芝菌丝很快革质化，会给转管时的操作带来困难。

（六）灵芝的生产

目前灵芝的生产主要有固体栽培（发酵）法和深层发酵法。固体栽培法经济有效，可以长出子实体和孢子，且取材方便，是一种有效的获取灵芝产品的方法；灵芝固体栽培有椴木栽培和代料栽培，采用适生树种（以壳斗科树种较理想，特别是青冈属、栲属和栎属树种最好）截成段栽培灵芝的方法称椴木栽培。以木屑、棉籽壳、甘蔗渣、农作物秸秆等农林下脚料为主要原料栽培灵芝的方法称为代料栽培。

固体栽培法的缺点是培养周期较长，且较难有效地确定培养终点和严格控制产物的含量、质量。深层发酵方法不受季节的影响，且液体菌种的培养周期短，成本低，能快速增殖菌体细胞，活性物质的有效成分易于控制，能显著提高生产效率等优点，受到人们的广泛关注。研究表明，液体深层发酵生产的灵芝多糖与来源于灵芝子实体、孢子的灵芝多糖具有相似的功效，液体深层发酵技术是获取灵芝多糖类化合物的重要手段。

二、实验简介

本实验分为两部分，第一部分为灵芝的固体栽培，第二部分为灵芝的深层生产工艺。通过这两部分内容的学习和实践，可全面掌握目前灵芝子实体、孢子粉、菌丝体及其活性成分的生产工艺技术，为今后从事灵芝产品的生产奠定理论和实践基础。

实验2-1　灵芝的固体栽培

（一）实验目的

学习和了解灵芝固体栽培工艺及原理，掌握灵芝栽培的菌种制作、扩大培养、培养基质制备与培养条件控制等操作技术。

（二）实验原理

灵芝固体栽培可以收获灵芝子实体和灵芝孢子，是目前灵芝产品生产的主要方式之一，栽培灵芝需为其菌丝生长提供适宜的营养和环境条件。

灵芝属腐生菌类。野生灵芝一般生长在阔叶树的倒木、枯木的树桩上。灵芝依靠菌丝前端分泌的多种酶（纤维素酶、半纤维素酶等），分解木材中的纤维素、半纤维素来获得菌丝生长所需的营养。用木屑及其他富含纤维索、半纤维素、木质素的农副产品下脚料，经过适当的配搭也能用来栽培灵芝。

灵芝菌丝体对温度的适应范围较宽，子实体阶段对温度适应范围相对较窄。菌丝生长的适温范围10～32℃，以26～28℃为最适；子实体原基分化温度18～28℃。子实体发育温度为18～30℃，以25～28℃为最适。若低于18℃，原基会变黄、僵化，不能正常分化；若长期处于30℃培养，虽然子实体生长较快，发育周期较短，但质地不紧密，皮壳的光泽也较差。

灵芝的生长发育需要充足的水分和较高的空气相对湿度。人工栽培时，培养基质的含水量控制在60%，培养期间空气相对湿度60%～70%。子实体生长期间要求较高的空气相对湿度，一般为80%～90%。

灵芝为好氧真菌。在子实体培养阶段，应特别注意加强通风换气，以利菌盖正常展开，二氧化碳浓度过高时，将抑制菌盖展开，常出现树枝状、鹿角状的畸形芝。

灵芝菌丝体生长速度随光照强度的增加而减慢。子实体发育则要求有较强的散射光，要求要有700～800lx光照度，否则将影响灵芝的色泽。全黑暗条件下不形成子实体。

灵芝属木腐生菌类。和其他木腐生菌类一样，喜欢在偏酸性的培养料中生长，pH以5～6为适宜。不适合在碱性环境下生长。

（三）实验材料

1.菌种

灵芝菌（Ganoderma lucidum）CGMCC5.653，中国普通微生物菌种保藏管理中心。

2.主要设备

三角瓶、广口瓶、试管、恒温培养箱、电热全自动灭菌器、超净工作台、电子分析天平、电炉、粉碎机、移液枪、干燥箱、pH计。

3.主要原料和试剂

马铃薯、葡萄糖、琼脂粉、木屑、麸皮或米糠、蔗糖、石膏粉。

（四）实验方法与步骤

1.实验流程

2.实验步骤

（1）母种的活化。

培养基（PDA培养基）：马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂粉2%。

马铃薯煮出汁加入葡萄糖和琼脂粉，加热融化后分装于试管，121℃灭菌30min。摆斜面，冷却，接种，于28℃培养箱培养7d。

（2）原种的培养。

培养基：木屑78%、麸皮或米糠20%、蔗糖1%、石膏粉1%、水55%～60%。

原料配好后，拌匀，装于广口瓶中，用扁形铁钩压紧，表面压平，洗净内外瓶壁，塞好棉塞，121℃灭菌30min，冷却后用试管菌种接于瓶中，25～28℃培养，菌丝长到瓶底后即为原种。原种可进一步扩大为栽培种，在栽培种瓶内直接长出子实体即是灵芝的瓶栽。

（3）栽培。

①木屑瓶栽灵芝。

A.培养基的配制。大多数阔叶树的木屑均可栽培灵芝，一般说，以栋、柞、栗、水曲柳、国槐等木屑为最好，桦、榆、椴、杨、柳、枣等木屑次之，但在生产上多用杂木屑作为栽培原料。在木屑中可加入部分麦麸或米糠，麦麸的用量为15%～25%。常用木屑培养基配方有：

木屑75%，麦麸25%，水适量。

木屑80%，米糠20%，水适量。

木屑75%，麦麸25%，硫酸铵0.2%，水适量。

木屑70%，麦麸28%，蔗糖1%，石膏1%，水适量。

木屑70%，麦麸28%，尿素0.1%，石膏1%，水适量。

木屑70%，麦麸20%，米糠10%，蔗糖1%，尿素0.2%，骨粉或过磷酸钙2%，石膏2%，水适量。

木屑60%，玉米秆粉（或甘蔗渣）40%，石膏2%，水适量。

木屑35%，棉壳35%，麦麸30%，另加石膏1%。

B.装瓶、灭菌、接种。用750g菌种瓶、广口瓶或500g罐头瓶都可栽培灵芝，以菌种瓶为最好。装瓶时，培养料的松紧、深浅要适当。装瓶过松，前期菌丝生长快，后期营养不足，保水差，培养基易干缩，难以形成菌盖，装瓶过紧，则透气性差，菌丝生长缓慢，出芝迟。装瓶太浅，往往造成菌柄过长，消耗养分多，长出菌盖小。装瓶过满，菌丝易长入棉塞，造成污染。一般以肉眼看来培养基较致密且略有空隙为合适。750g菌种瓶装料量约500g。

装瓶后，121℃灭菌30min、冷却、接种，每瓶原种可接50～60瓶。

C.菌丝培养。接种后，将瓶子搬入培养室内，竖放在床架上培养。室温应保持在26～28℃，约经1周，菌丝可覆盖整个培养基，且向下深入1～2cm。在室温过高（30℃以上）、通气不良和光线过强情况下，往往会造成菌丝向上徒长，加速菌丝老化变色，表面菌丝变黄，影响子实体的形成。在这种情况下，应加强通风换气，进行降温，对表面黄色菌皮可用消毒钳子拨去，经通风降温，仍可形成子实体。

D.子实体培养。菌丝生长到一定程度，培养基表面会出现白色疙瘩状突起，为子实体原基。原基出现时间，因培养温度、菌株特性而异，一般是在菌丝长满1/2或2/3瓶时，便有原基出现。原基大多发生在种块上，有时沿瓶壁上发生。原基出现后，要及时拔去棉塞或封口纸。拔塞过迟，菌柄长进棉塞，拔塞时会使子实体受到损伤，棉塞还会吸收菌丝体水分而易感染杂菌。若不拔棉塞，虽然子实体可透过棉塞长出来，形态不正常，并容易发生污染。原基形成后，约经2～3周，即可向上延伸成菌柄长出瓶口。与此同时，菌丝继续向下生长，在瓶内长透。此时室温仍应保持在26～28℃，相对湿度要提高到80%～90%，定期开窗通风，气温高时在上午8～10时及下午3～4时开窗换气，气温低时在中午通风，并给予适当光照。若湿度不足，菌柄生长前端脱水发黄，在过分黑暗条件下菌柄向上延伸很长，成为畸形菇，光线过强，菌柄刚冒出瓶口就分化成菌盖，会降低产量，阳光直射床架，菌柄容易枯萎僵化。

图1-2-2　瓶栽灵芝

菌柄长出瓶口后，得到充足新鲜氧气供应，继续上长1.5～3cm后，便开始形成菌盖（图1-2-2）。菌盖的生长方式是沿着水平方向一轮轮向外生长的，直至整个菌盖形成。当菌盖周边的白色生长点消失时，菌盖已停止长大，但仍可继续加厚。由于品种不同，有的菌柄只长一个菌盖（单生），有的同时长几个菌盖（多生），菌盖多生的产量一般较高，菌盖生长的条件要求与菌柄生长相同，通风不良、光照过暗，都会影响到菌盖的形成，或形成鹿角状分枝的畸形菇；在弱光照下形成的菌盖，细胞壁沉积色素少，并没有光泽。灵芝菌盖有明显趋光性，其菌盖向透光面或强光面展开。因此，在菌盖生长期间绝对不要任意调动瓶子位置，否则，会形成畸形菇。当菌盖周边白色生长点消失，瓶肩上有褐色粉状物出现（灵芝孢子），即可采收。整个生长周期约50～60d。每瓶产灵芝50～60g。

灵芝采摘后，将瓶口消毒，重新封口，培养10～15d后，能形成新的菌蕾，可按上述方法管理。

灵芝子实体成熟后会弹射大量孢子。灵芝孢子有药用价值，可以垫一张白纸或薄膜在瓶下收集，为防止孢子飞散，还可在床架上围一道透明薄膜，在子实体上套一个纸套更好。每个菌种可收1.5～3g孢子。

②短椴木栽培灵芝。

选用榆、杨等阔叶树，直径不超过10cm，于落叶后砍伐，截段后架晒，5月下旬打洞接种，除人工培育之木屑种或种木种外，还可将已经长过1年的健康灵芝椴木、野生灵芝的“寄主”树木加工成楔形种木接种。

接种后，呈井字形上堆发酵，堆高不超过75cm，堆温保持在27～28℃，相对湿度保持在65%～70%，若湿度过低，在地面或空中喷水调节。经10～15d培养，菌丝已由接种穴向四周蔓延生长。劈开椴木的接种穴进行检查，凡菌丝生长地方，木质部呈现黄褐色，证明菌丝已成活。

图1-2-3　椴木覆沙养菌

当菌丝由接种穴向外蔓延生长时，为使菌丝在椴木内能得到充分发育，将椴木散堆，选地势较高、无直射阳光、阴凉的场所，把椴木成排横卧地面，用湿沙覆盖（用一半黄沙，一半黄土），并适当喷水保湿（图1-2-3）。

1个月后，将椴木挖出进行检查，其方法是，将椴木锯成10～15cm的短木段，然后堆砌在阴凉潮湿的地方。如湿度不够，每天应在周围对空喷水数次，使相对湿度保持在85%～95%。经1～3d，若横断面出现白色薄层，系灵芝气生菌丝或草酸钙的分泌物，说明灵芝菌丝已在木材内长透。这时可将全部堆木挖出，锯成10～15cm木段，垂直埋入土中，埋入深度为椴木全长的2/3至3/4，即稍微露出地面。埋椴木的地方最好选树荫或瓜棚下，避免太阳曝晒或雨水冲刷，特别要注意防止白蚁危害。埋木期间，要经常喷水保持土壤湿润，空气相对湿度保持在85%～95%。

椴木栽培灵芝，一般在接种后2个月能形成菌蕾，子实体成熟需50～60d。因此，从接种到采收需要4个月左右时间。采收后，若气候条件适宜，会长出新的菌蕾，2个月后又可采收。越冬期间，仍要保持沙土湿度，防止椴木内菌丝脱水死亡。第2年气温回升后（25℃以上），再按前述方法栽培，较大的椴木可产菇2～3年。

③椴木栽培灵芝。

椴木栽培灵芝，是在椴木上钻穴，接上菌种，经过发菌管理，从椴木上长出灵芝，栽培过程有制种、椴木准备、接种发菌、埋菌棒和管理等。

A.制种。用椴木栽培灵芝，以抗逆力强的木块菌种为好，在水分、湿度变化较大的情况下，菌种不易衰老死亡。制菌种用的木块，要求质地坚硬，树皮较薄，常用的有桑、槐、悬铃木等，剪成长1.5cm、直径1.2cm的小圆木块，平时晒干，制种时将小木块放入营养液中（100mL水中，加蔗糖2g，麸皮或米糠5g），煮沸，半小时后捞起，按4∶1的比例，将木块与制常规菌种用的木屑、麸皮培养料混合，装入瓶中，并用木屑麸皮培养料覆盖，压平。灭菌，接种，培养和常规制种同，待留丝长到瓶底，再过10d左右，就可用于接种。

B.椴木准备。一般阔叶树的椴木均能栽培灵芝，但木质较坚硬的桦树、栎树、野樱桃、悬铃木、枫香等树种比较理想，椴木直径要求8～15cm，长1米左右，一般在二三月份伐树，含水量高不易枯死的树木，应适当提早砍伐。然后截去树枝，放于阴凉处，使水分慢慢蒸发，接种时，椴木含水量以37%～40%为宜。如含水量低，接种前应在水中浸1～2d，含水量高，可将椴木放在室外吹干，接种时的椴木要求完全枯死，以免发菌期椴木返青发芽，导致菌种死亡。

C.接种。接种穴用电钻钻穴，穴略小于菌种块，使接种块能塞紧接种穴，穴距8～10cm，行距6～8cm，接种时，从瓶中挖出菌种，剥去菌膜，先用少量木屑菌种填入穴内，然后再塞上菌种块，用榔头敲紧，要边钻穴边接种，接种后立即用塑料薄膜覆盖，防止种穴干燥而影响菌种成活。

D.堆棒发菌。椴木接种之后，随即堆棒。堆法是：一层椴木横放，一层直放，堆高3～4尺，宽度为一根椴木，长度不限，然后用塑料薄膜覆盖，下部用砖瓦压紧，密封。阳光强烈时，覆盖草帘，减少光照，白天堆温保持在25～28℃，晚上盖好草帘保温，每隔6～7d翻一次堆，将上下内外的椴木相互调换位置。第一次翻堆后仍密封，以后几次翻堆，覆盖的塑料薄膜不必着地，留些空隙。如发现杂菌，可将塑料薄膜揭起，以降低湿度，抑制杂菌生长。如果椴木变干，树皮呈白色，在翻堆时要适当浇水，但要到树皮表面无水迹时，才可覆盖薄膜。一个月后，菌丝已深入木质部，即可埋菌棒。

E.埋菌棒。椴木发好菌后，应及时埋入土中，埋菌棒的畦宽4.5尺左右，先挖去畦的表土2～3寸，在畦内洒消毒粉，再洒上少许土，将消毒粉盖没，然后排放一层菌棒，菌棒间距离一指宽，中间用细土填实，不要有空隙，否则菌棒易发生杂菌，然后再在菌棒上覆1寸厚的土，畦的两边要开排水沟。

F.搭荫棚。埋好菌棒后，在畦上搭荫棚，高1尺左右，先铺塑料薄膜，再盖草帘，以防阳光直射和雨水冲刷。

G.水分管理。菌棒埋好后，畦面每天喷1～2次水，保持土面湿润，但也不能过湿而粘手，并随时拔去畦面杂草。冬天必须注意保湿，土面干，开春后子实体形成迟，子实体长大时就会遇到高温干旱而长不足。冬天保湿的方法是在土面上覆一层草，不必喷水。

H.采收。灵芝子实体边缘开始变红，菌盖开始革质化时，就应及时采收。子实体过分幼嫩时采收产量固然会低，但子实体生长过老，药效就差，而且也会影响第二批子实体的生长。

椴木接种灵芝，如果接种早，发菌好，7月初就能形成子实体，到高温时已基本长成。但是第一年产量较低，第二年4～5月份，可形成大量子实体，占总产量的70%～80%。每100kg椴木，两年中可收干灵芝2.5～3kg。

（五）实验结果与分析

记录灵芝菌丝、子实体原基、菌柄、菌盖的生长情况。

实验2-2　灵芝的液体发酵

（一）实验目的

灵芝的液体发酵是典型的好氧发酵，但发酵时间较长、容易染菌，以该菌为实验对象，可以使学生熟悉微生物与发酵操作，即使由于染菌而至发酵失败，也能使同学们认识到规范操作对发酵生产的重要性。学习灵芝菌的液体发酵生产，有助于对其他好氧发酵的理解与掌握，也有助于对已掌握的生化、微生物知识的融会贯通。

（二）实验原理

灵芝（Ganoderma lucidum）是中国的传统名贵中药，现代药理研究表明它有抗衰老、提高机体免疫功能、抑制肿瘤、抗病毒和保肝护肝等作用，主要活性成分为灵芝多糖、灵芝三萜类化合物以及活性蛋白类成分等。目前，野生灵芝稀少，大多采用人工栽培的灵芝子实体加工成各种药物和保健食品。近年来，液体培养以其生产周期短、培养物营养丰富以及便于收集加工等优点而越来越受到重视。灵芝的液体培养，首先要提供适合灵芝生长代谢的营养条件，其次要提供适宜的pH值、溶氧、温度等环境条件。摇瓶发酵时，溶氧通过调节摇瓶的装液量和摇床的转速来实现，发酵罐发酵通过调节通气量或（和）调整气体含氧量来实现。灵芝液体发酵是一个逐级扩大培养的过程，在进行灵芝菌的发酵罐液体发酵之前，必须准备好足够量、生长旺盛的发酵菌种。在灵芝菌的液体发酵中，接种量一般为培养基体积的10%，因此，要进行大规模的发酵，首先必须进行灵芝菌的种子扩大培养，以获得足量的菌种。然后在发酵罐的液体培养基中接入灵芝菌，提供适宜的温度、溶氧等条件使灵芝菌丝进行生长，生产灵芝多糖等活性成分。

（三）实验材料

1.菌种

灵芝菌（Ganoderma lucidum）CGMCC5.653，中国普通微生物菌种保藏管理中心。

2.主要设备

三角瓶、试管、恒温培养箱、摇床、灭菌设备、超净工作台、电子分析天平、电炉、粉碎机、移液枪、干燥箱、pH计、分光光度计、比色用试管、水浴锅。

发酵罐系统（含蒸汽发生器、空压机等）。

8%的苯酚、浓硫酸、3，5-二硝基水杨酸、亚硫酸钠、氢氧化钠、酒石酸钾钠。

3.主要试剂

马铃薯、葡萄糖、琼脂粉、玉米粉、豆饼粉、麸皮、mgSO4、K2HPO4。

（四）实验方法与步骤

1.实验流程

2.实验步骤

（1）菌种活化。

培养基（PDA培养基）：马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂粉2%。

马铃薯煮出汁加入葡萄糖和琼脂粉，加热融化后分装于试管，121℃灭菌30min。摆斜面，冷却，接种，于28℃培养箱培养7d。

（2）种子制备。

①培养基的配制与灭菌。

培养基：葡萄糖20g/L，玉米粉20g/L，豆饼粉10g/L，mgSO40.75g/L，K2HPO41.5g/L。

根据培养基配方称量配制，分装于250mL三角瓶中，每瓶装液量100mL，十二层纱布封瓶口，121℃，灭菌30min。

②接种。

培养基冷却后，在超净台内从试管菌种中，用接种铲挑取灵芝菌丝接入三角瓶中，火焰烧瓶口，纱布封闭。

③培养。

将接好种的三角瓶置于摇瓶柜中培养，温度28℃，转速150r/min，培养7d。

（3）发酵。

①培养基的配制。

培养基：葡萄糖20g/L，玉米粉20g/L，豆饼粉10g/L，mgSO40.75g/L，K2HPO41.5g/L。

②摇瓶发酵。

根据培养基配方称量配制，分装于500mL三角瓶中，每瓶装液量150mL，十二层纱布封瓶口，121℃，灭菌30min。培养基冷却后，在超净台内用移液管将灵芝种子液接入三角瓶中，接种量10%，火焰烧瓶口，纱布封闭。将接好种的三角瓶置于摇瓶柜中培养，温度28℃，转速150r/min，培养5d。

③发酵罐发酵。

根据培养基配方称量配制，装入发酵罐中，121℃，灭菌30min。培养基冷却后，将灵芝种子液在火焰条件下、从接种口接入发酵罐，接种量10%。调整通气量为1∶（0.3-0.5）VVM，搅拌转速150r/min，发酵5d。

（4）发酵过程中还原糖的测定（DNS法）。

①试剂：3，5-二硝基水杨酸试剂。

3，5-二硝基水杨酸　　　　　1%

苯酚　　　　　　　　　　　　0.2%

亚硫酸钠　　　　　　　　　　0.05%

氢氧化钠　　　　　　　　　　1%

酒石酸钾钠　　　　　　　　　20%

配好后存棕色瓶中一周后稳定。

②标准曲线的绘制。

配制1mg/mL的葡萄糖标准溶液，取6支试管，分别按下表顺序加入各种试剂。混匀后置100℃恒温水浴保温5min，立即用流动水冷却。最后加蒸馏水稀释至25mL。混匀后，于550nm比色。以光吸收值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。

③测定。

取待测样品（含糖50～100μg）和对照（蒸馏水）各2mL，分别加入3mL的DNS试剂，沸水浴煮沸5min显色，冷却后用蒸馏水稀释至25mL，用分光光度计在550nm比色，以对照液调零点，测得吸光度。用预先以葡萄糖作好的标准曲线即可计算出样品中的含糖量。

（5）发酵过程中灵芝多糖的测定（硫酸苯酚法）。

①试剂。

8%的苯酚、浓硫酸。

②标准曲线的绘制。

配制100μg/mL葡萄糖标准液。取10mL刻度试管6支，用0～5分别编号，按表加入溶液和水，然后按顺序向试管内加入1mL8%苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以5～20s时间加入5mL浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8mL，在室温下放置30min，显色。然后以空白为参比，在490nm波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。

③测定。

取适当稀释后的溶液2mL加入苯酚1mL混匀后再加入5mL浓硫酸混匀，静置15min后用分光光度计在490nm波长处，以试剂空白为参比测定吸光度值。再以标准曲线来计算多糖含量。

（五）实验结果与分析

绘制灵芝发酵过程中还原糖、多糖、pH值随时间变化的曲线。

参考文献

［1］陈士瑜.食用菌生产大全［M］.北京：农业出版社，1988.

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［3］上海市农业科学研究院.食用菌栽培技术［M］.北京：农业出版社，1983.

［4］陶文沂，敖宗华，许泓瑜，等.药食用真菌生物技术［M］.北京：化学工业出版社，2007.

［5］张松.食用菌学［M］.广州：华南理工大学出版社，2000.

［6］徐锦堂.中国药用真菌学［M］.北京：北京医科大学-中国协和医科大学联合出版社，1997.

［7］杨海龙，活泼，肖彩霞，等.药用真菌深层发酵生产技术［M］.北京：化学工业出版社，2009.

［9］Kino K，Yamashita A，Yamaoka K，et al.Isolation and Characterization of a New Immunomodulatory Protein，LingZhi-8（LZ-8），Ganoderma lucidium［J］.Biol Chem，1989（1）.

（编者：杨海龙）