综合实验五 食醋酿造技术
一、背景知识
（一）食醋的生产历史
在国外，公元前五千年，古巴比伦就有较为古老的酿醋记录，是以椰枣汁、树液以及葡萄干酿酒，再以酒生产醋。《圣经》中有Essiggenus一词，其含义是醋，至今德语的醋就是Essis。在《摩西五书》中，有要求修道者发誓远离各种酒的记载，“也不可饮葡萄酒等酿成的醋”。这些史实表明，在公元前13世纪的亚、欧、非结合部就已经有醋。按文字记载，我国食醋的酿造已有二千多年历史。历代对醋的记载不少。如《论语》在《公冶长》篇中有：“子曰：‘孰谓微生高直，或乞醯焉，乞诸其邻而与之。’”北魏贾思勰著《齐民要术》在《作酢法第七十一》篇中，详尽叙述23种制醋技术。《北堂书钞》记有：“吴地志云：‘吴王筑城以贮醯醢，今俗人呼为苦酒城。’”。此外，在《隋书·酷吏传》《汉武内传》《庶物异名疏》《晋公遗语》《说郭·龙城录》等古籍中亦有醋的记载。近代以来，醋已经变成了人们日常生活中不可或缺的重要调味品。醋的生产也从制酒业中独立出来。18世纪末，德国、法国、英国等已出现了制醋大企业，并使用玉米、大麦等为原料进行工业化生产醋。19世纪，美国紧跟英国，也开展了食醋的大规模生产。在新中国成立前，我国食醋生产沿用古老落后的生产工艺，生产规模较小。新中国成立后，食醋生产工艺和设备有了很大的改进。1956年济南酿造厂推出了利用纯种曲霉和酵母进行固态糖化和酒精发酵的新固态发酵法；1967年，上海市酿造科学研究所创造了酶法液化自然通风回流的固态发酵工艺；1972年，山西长治市副食品加工厂试产成功生料制醋新工艺，同年液态深层发酵法新工艺也得到广泛应用；1977年，自吸式充气发酵罐已应用于液醋生产。目前，国外大多数酿造企业均采用这种方式生产食醋。而我国占主导地位的仍是传统的固态发酵法和静置表面发酵法，深层液体发酵法将是我国大规模生产食醋的一个重要方向。
（二）食醋的发酵工艺与种类
根据国家及行业标准，可将食醋分为配制食醋和酿造食醋。配制食醋是以酿造食醋为主体，与冰乙酸、食品添加剂等混合配制而成的调味食醋。要求配制食醋中酿造食醋的比例（以乙酸计）不得小于50%。酿造食醋由于其发酵工艺的不同可分为固态发酵醋、静止表面发酵醋和液态发酵醋三种。固态发酵工艺酿制的食醋色泽深褐，香气浓郁，口感酸而不涩，风味较佳，但发酵周期长，自动化程度低，原料出醋率低，质量不稳定。静止表面发酵法是利用醋酸菌的特性，在接入酵母菌的酒醪表面覆盖醋酸菌膜进行发酵，该工艺操作容易，设备简单，但占地面积大，发酵周期长，发酵效率低。液态深层发酵法实现了制醋生产机械化、管道化，减轻了工人的体力劳动强度；广开原料来源，提高了劳动效率，是酿造调味品工业的一项革新，但液态发酵工艺生产的食醋风味和色泽较差。
（三）食醋的功能
食醋成分较为复杂，但营养丰富。除了含有醋酸、乳酸、琥珀酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、蚁酸、酮戊二酸、焦谷氨酸等有机酸外，还含有谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、赖氨酸、缬氨酸、苏氨酸等18种游离的氨基酸。此外，还含有葡萄糖、果糖、甘露糖、阿拉伯糖、核糖、木糖、棉子糖等小分子糖类以及酯、醛、酚和双乙酰等呈味物质。因此，食醋不仅仅是一种酸性调味品，具有增强食欲的作用，而且对人体还具有更重要的多种营养保健功能。如《本草纲目》曾有记载，“醋，酸温散淤解毒，下气消食，开胃气，散水气，治心腹血气痛、产后血晕、症结痰癖、黄疽痈肿、口舌生疮、损伤积血”。《本草纲目》也认为，“醋能消肿，散水气，杀邪毒，理诸药”。通过现代医学的进一步证实，已经可以确定食醋的确具有明显的医疗保健的功效。
抗菌消炎、防治感冒。
软化血管、降低血压、降低血脂。
促进新陈代谢，分解乳酸，消除疲劳。
开胃消食，促进钙的吸收。
抗氧化、抗衰老。
（四）国内名醋
我国地域辽阔且制醋历史久远。各地人民因地制宜创造出工艺迥异、风格不同的多种制酷方法，其所酿制产品不仅具有独特的风味，且呈现出鲜明的地方特色。如我国著名的名醋有山西老陈醋、镇江香醋、四川麸醋、浙江玫瑰米醋、福建永春老醋，其他具有一定知名度的食醋还有天津独留老醋和河南彰德陈醋等。
1.山西老陈醋
山西老陈醋是北方最著名的食醋，创始于三百多年前的清初顺治年间。素有“天下第一醋”的盛誉，以色、香、醇、浓、酸五大特征著称于世。产品色泽黑紫、味清香、质浓稠、酸味醇厚、回味绵长。工艺特点是：以优质高粱为主要原料，以麦曲为糖化剂，经特殊的加工过程酿制而成。山西老陈醋用曲量大，大曲用量为主要原料高粱的62.5%，采用低温酒精发酵，高温醋化，醋酸发酵温度达43～45℃。陈酿期长。
2.镇江香醋
镇江香醋为江南著名的食醋之一，从1850年开始生产至今已有160余年历史。工艺特点为以糯米为主要原料，经浸泡、沥干、蒸熟、冷却、拌入酒药、酿成酒酿。然后分次拌入麸皮谷糠，用固态分层发酵法进行醋酸发酵，先后经过40多道工序，历时60余天，再经淋醋、加砂糖、炒米色。产品“酸而不涩，香而微甜，色浓味鲜”。与山西老陈醋相比，镇江香醋的最大特点在于微甜。尤其蘸以江南的肉馅小吃食用时，微甜更能体现小吃的鲜美。
3.四川麸醋
四川麸醋始创于明末清初，迄今已有400多年历史。因产于四川阆中（古称保宁府），故又称“保宁醋”。1915年曾在巴拿马太平洋万国博览会与茅台一并获得金奖，因此又有“国醋”之称。其工艺特点是以麸皮为主要酿醋原料，以药曲和辣蓼汁制造酵母为发酵剂，经14d发酵后进行陈酿，陈酿期长达1年以上。产品色泽黑褐，酸味浓厚，稍带鲜，有特殊芳香。
4.浙江玫瑰米醋
玫瑰米醋是以大米为原料酿造而成的，因为产于浙江一带，醋液呈透明的玫瑰红色，故又名“浙醋”“红醋”。工艺特点为以大米为原料，经浸泡、洗净、沥干、蒸熟成饭后装入缸中，利用自然落入的微生物生长繁殖。5～6d后，米饭上生长各种曲霉、毛霉、根霉，然后加水发酵3～4个月，压榨，配制成品。醋液呈玫瑰红色，透明、香气纯正、口味酸而醇厚、略带鲜甜味。它与其他醋的风味有较大差别。玫瑰米醋具有浓郁的、能促进食欲的特殊清香味，并且醋酸的含量不高，故醋味不烈，非常适口。
5.福建永春老醋
永春老醋又名乌醋，是福建省传统名特调味佳品，与山西老陈醋、镇江香醋、四川麸醋并列“中国四大名醋”。其工艺特点是选用糯米为主要原料，经浸泡、淘洗、沥干、蒸熟、拌入红曲、入缸、堆积发酵，然后分次加入米和水，经70d酒精发酵结束。接入醋母进行醋酸发酵。1年后分割法取醋。它具有色泽棕黑、酸中带甘、醇香爽口、久藏不腐等特点。既是质地优良的调味品，又兼有治病妙用，可防治腮腺炎、胆道蛔虫、感冒等疾病。
（五）食醋的行业标准
根据《GB18187—2000酿造食醋》标准，食醋的品质受三个指标影响，分别是总酸、不挥发酸和可溶性无盐固形物。无论哪种发酵工艺，该标准对食醋的总酸要求在3.5g/d L以上。见表1-5-1。
表1-5-1 发酵食醋理化指标
注：以酒精为原料的液态发酵食醋不要求可溶性无盐固形物。
二、实验简介
本实验分为两部分，第一部分为传统固态酿醋工艺，第二部分为深层液态酿醋工艺，涵盖了目前市场米醋生产的两种主要的发酵工艺技术，通过这两部分内容的学习和实践，可为今后从事米醋的工业发酵生产奠定理论和实践基础。
实验5-1 固态食醋酿造技术
（一）实验目的
学习和了解固态食醋酿造工艺及原理，理解固态食醋酿造工艺中糖化曲制备工艺及食醋发酵工艺参数，掌握固态食醋酿造工艺操作技术。
（二）实验原理
固态发酵制醋工艺在我国食醋工业仍占有较高的地位，其主要原因在于：
1.品质上乘，市场占有率高，采用固态发酵工艺酿制的食醋色、香、味、体俱佳，通常色泽深艳，呈琥珀色或红棕色。
2.具有浓郁的醇香和酯香；酸味柔和，回味醇厚；体浓澄清。
3.总酸、不挥发酸、还原糖等主要理化指标优异；含有多种氨基酸所具有的缓冲调和作用、菌体自溶后产生的各种风味物质的作用，使产品醋酸含量虽高，却无尖锐刺激感，而给人以柔和、醇厚、绵长、协调的舒适感，其明显的优良品质远非深层液态发酵制醋等其他工艺所能及。
固态发酵制醋主要原理与过程为，淀粉类物质（大米、高粱、玉米等）中的淀粉在麸曲（由产淀粉酶的微生物如黑曲霉、米曲霉、红曲霉、宁佐美曲霉等发酵制成的糖化剂）的作用下水解为可发酵性糖（糖化），在无氧条件下酒精酵母经过糖酵解途径将淀粉降解的可发酵性糖变成酒精（酒精发酵），酒精进而在醋酸杆菌氧化酶的作用下生成醋酸（醋酸发酵）。
（三）实验材料
1.菌种
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC1001，中国食品发酵工业研究院。
醋酸杆菌（Acetate bacillary），沪酿1.01（上海市酿造科学研究所）或AS1.41（中国科学院微生物研究所）。
黑曲霉（Aspergillus niger）AS3.4309，中国科学院微生物研究所。
2.主要设备
三角瓶、恒温培养箱、摇床、灭菌设备、超净工作台、恒温水浴锅、电子分析天平、电炉、粉碎机、移液枪、试管、温度计、不锈钢锅、干燥箱、pH计、酒精计、磁力搅拌器、滴定管、显微镜。
3.主要试剂
酒精、葡萄糖、碳酸钙，AR级。
酵母膏、琼脂、麦芽浸粉、蛋白胨，BR级。
大米、麸皮、食盐、马铃薯，市售。
4.培养基及其制备
（1）斜面试管培养基
A.酵母菌斜面试管培养基
麦芽浸粉1.5g，琼脂2.0g，水100mL，pH 6.0，在0.1MPa压力下灭菌20min。
B.醋酸杆菌斜面试管培养基
酒精2.0g，葡萄糖1.0g，酵母膏1.0g，碳酸钙1.5g，琼脂2.5g，水100mL，各成分完全溶解后，再添加酒精，在0.1MPa压力下灭菌20min。
C.黑曲霉斜面试管培养基
PDA培养基：马铃薯20.0g，葡萄糖2.0g，琼脂2.0g，水100mL，pH自然，在0.1MPa压力下灭菌20min。
（2）三角瓶种子培养基
A.酵母菌种子培养基
麦芽浸粉2.0g，调整pH 5.0，在0.1MPa压力下灭菌20min。
B.醋酸杆菌种子培养基
酒精4.0g，葡萄糖1.0g，酵母膏1.0g，碳酸钙1.5g，水100mL，在0.1MPa压力下灭菌20min。酒精在灭菌后无菌条件下加入。
C.黑曲霉种子培养基：
麸皮80g，水100mL，拌匀过筛，在300mL的三角瓶内装入30g，在0.1MPa压力下灭菌30min。
（四）实验方法
1.糖化酶含量测定方法
糖化酶含量测定方法见附录2-11。
2.酒精度测定方法
酒精度测定方法见附录2-6。
3.总酸测定方法
总酸测定方法见附录2-5。
4.微生物总数测定方法
微生物总数测定方法见附录2-12。
（五）实验步骤
1.实验流程
图1-5-1 固态食醋酿造工艺流程
图1-5-2 三角瓶麸曲制备工艺流程
2.实验步骤
（1）麸曲的制备
A.试管斜面培养
将冰箱保藏菌种在超净工作台中接种于黑曲霉试管斜面培养基，置于30℃恒温培养箱中恒温培养3～5d，至出现大量的黑色孢子。
B.三角瓶麸曲制备
三角瓶麸皮培养基灭菌后，趁热摇散培养基，冬天冷却至40℃下，夏天冷却至30℃左右，在无菌操作条件下，用接种环挑取已培养好的试管原种中的黑曲霉孢子，接入到三角瓶麸皮培养基中，摇匀，30℃下置于恒温培养箱中进行恒温培养。当瓶内曲料稍微结块时，摇瓶将结块摇碎。继续培养，待孢子由黄色变成黑褐色即可使用。
（2）酒母的制备
A.试管培养
在无菌操作条件下，将冰箱保藏的酵母菌试管原种画线接入酵母菌斜面试管培养基中，26～28℃置于恒温培养箱进行恒温培养约3d，当菌落全部长好后备用（4℃冰箱内保存）。
B.三角瓶培养
从培养好的斜面试管中挑取1～2环接入已灭菌并冷却的三角瓶培养基中，摇匀后，置于26～28℃恒温摇床中160r/min振荡培养，24h后达到酵母生长旺盛期。镜检菌体生长正常、无杂菌，要求酵母细胞数为1×108个以上，出芽率在15% ～30%，酵母死亡率＜1%。
（3）醋母制备
A.试管培养
在无菌操作的条件下，将冰箱保藏的醋酸菌原菌画线接入醋酸菌斜面试管培养基中，在30～32℃下培养48h，当菌落全部长好后备用（4℃冰箱内保存）。
B.三角瓶扩大培养
在已长好的试管菌种中加入10mL的无菌水，用接种环将接斜面上的菌体刮到无菌水中，制作成菌体悬液，用5mL移液枪无菌操作下吸取3mL加入醋酸菌三角瓶培养基，摇匀，在32～34℃恒温摇床上180r/min振荡培养24～30h，有醋酸清香，镜检菌体生长正常、无杂菌即可使用。
（4）糖化及酒精发酵
A.原料预处理
取1000g大米用粉碎机粉碎成粉状，将1800g麸皮摊平在不锈钢锅里，将米粉倒在麸皮上，拌和均匀。在物料里加入2800g 60℃左右的温水，边加边翻拌，充分拌匀，使物料充分吸水。
B.蒸料
蒸料的目的是使植物组织和细胞彻底破裂，从而使组织内的淀粉充分吸水、受热而膨胀糊化，易于淀粉酶发挥作用；杀灭原料中的微生物，防止杂菌污染；软化辅料基质，使其膨胀松软，增加吸水性能。可以常压蒸煮或0.01MPa加压蒸料30min。
C.摊晾
取出熟料置于干净的不锈锅上，用玻棒搅匀并打散团块，同时迅速冷却，夏季降温至30℃左右，冬季降温至40℃以下，第二次撒1300mL冷开水，翻拌—次后摊平。
（5）糖化及酒精发酵
将制作好的麸曲按料曲比2∶1的比例撒在冷却好的物料表面，再将酒母（接种量为主原料的40%）振荡均匀后撒上，翻拌均匀后装入坛内进行发酵。入坛后摊平压实，温度控制在24～28℃，当品温超过38～40℃时进行倒醅，即将醅倒入另一个干净的坛子中，每隔1h测定一次温度，品温上升到35℃后，再次倒醅，此后，品温维持在33～35℃，不得超过37℃，每天倒醅一次，5～7d完成，结束糖化与酒精发酵。要求成熟的酒醅中酒精产量在7%～8%，不低于6%。
（6）醋酸发酵
将主原料的100%～120%谷壳或粗谷糠及40%的醋母撒在罐内，翻拌均匀后，在表面再撒少量的醋母，以抑制杂菌利于发酵。第2～3d品温升高很快，控制在39～41℃，不超过42℃。超过42℃易出现烧醅并有异味。每天倒醅或翻醅一次，以通气供氧及调节品温，翻醅多则通气量多，故多翻品温反而升高。12～20d左右，品温降至35℃以下，醋酸发酵结束。要求有正常醋香，略有酒香和酯香，酸度（以乙酸计）在6%～7%。
（7）加盐和后熟
醋酸发酵后立即加盐，以防止醋酸的过度氧化作用，醋酸菌对食盐的耐受力极弱，1%的食盐浓度即可终止醋酸菌的活动。醋酸发酵结束时应立即加食盐水，夏季加2%，冬季加1.5%。加盐方法是：将一半量的盐混匀在上半缸醋醅内，并移入空坛，24h后，将另一半食盐拌入余下的醋醅内，混匀后转入上半缸内，加盖放置2～5d，使其成熟并增加色泽和香气。
（8）淋醋
可采用单淋法即成熟醋醅用开水浸泡24h，然后淋出醋液。也可采用三套循环法。即先用二醋浸泡成熟醋醅20～24h，淋出来的是头醋，剩下的头渣用三醋浸泡，淋出来的是二醋，坛内的二渣再用清水浸泡，淋出三醋。
（9）陈酿、澄清
陈酿是醋酸发酵后为改善食醋风味进行的储存、后熟过程。将醋液贮入缸或罐中，封存1～2个月进行陈酿和沉淀，可得到香味醇厚、色泽鲜艳的陈醋。
（10）配兑及灭菌
经过陈酿的醋或新淋出的头醋仍为半成品，食用前需按质量标准进行配兑，醋酸含量大于5%的为一级食醋，醋酸含量大于3.5%的为二级醋，灭菌温度控制在80℃以上，时间10min。
（六）实验结果与分析
1.麸曲外观描述及糖化酶含量测定。
2.对培养好的酒母质量进行分析。
表1-5-2 酒母的质量指标
（1）酵母的细胞数用血球计数法计算。
（2）出芽率指出芽的酵母细胞占总酵母细胞数的比例。随机选择5个视野，观察出芽酵母细胞所占的比例，取平均值。
（3）用美蓝对酵母细胞进行染色，蓝者为死细胞（代谢停止，无还原能力），无色为活细胞（还原能力强，蓝色变无色）。
3.糖化及酒精发酵过程中酒精度的变化
表1-5-3 糖化及酒精发酵过程中酒精度的变化
4.醋酸发酵过程中酸度的变化
表1-5-4 醋酸发酵过程中酸度的变化
5.成品醋酸主要理化指标及微生物指标
表1-5-5 成品醋酸主要理化指标及微生物指标
（七）实验注意事项
1.麸曲质量直接影响到原料淀粉的糖化，从而影响到原料的出品率，要求曲色米黄，无干皮夹心，菌丝粗壮，孢子尚未形成，有正常曲香，无怪味或酸味，曲块结实、用手轻捏，松而不硬。
2.酒母质量与酒精发酵效果有直接关系。只有培养出优良健壮的酒母，才能提高酒精发酵率，在生产中要求酒母中酵母细胞形态整齐，健壮，细胞多，杂菌少，降糖快。
3.注意控制醋酸发酵过程中的水分含量。认真掌握醋醅的含水量，原料加水量对原料熟度和淀粉糊化关系很大。加水量少，部分淀粉粒未能润水膨胀，糊化困难。加水量多，蒸料时局部料层极易压住蒸汽，使原料熟度不均，造成发酵过程中醋醅发黏，影响出品率。所以采用蒸料前后两次加水调整的方法。醅的质量为主料占80%～85%，水分60%～62%。
4.严格控制各阶段的温度。温度过低，酶糖化及菌体生长速度慢，过高会抑制菌体的生长及酶的活性，因此，在制醋各个阶段都需严格控制好温度，熟料摊晾加麸曲和酒母时，品温控制很重要。入坛适温为25℃左右；糖化与酒精发酵35～37℃；醋酸发酵38～41℃；超过42℃易出现烧醅并有异味。
5.固体酿制食醋工艺为开放性环境，注意环境卫生及无菌操作，防止发酵过程染菌。
实验5-2 深层液态食醋酿造技术
（一）实验目的
学习和掌握米醋液态深层生产工艺，理解在米醋生产工艺中各菌种作用及发酵工艺参数。
（二）实验原理
液态深层发酵是20世纪50年代发展起来的一种新工艺，由德国的Heinrich Frings Jun.和Heinrich Els.将原来用于工业化生长抗生素的发酵罐经改造后，成功应用在液态深层酿醋技术上，并于1956年获得了专利。我国在20世纪70年代，上海醋厂在有关单位的协作配合下，采用液态深层发酵法工艺制醋成功。以后，郑州酿造厂又从医药工业引进自吸式发酵罐，适应了新工艺的需要。液态深层发酵法制醋是较为先进的技术，其要点是采用强制通风和控制温度的方法，短时间内将发酵酒液及经扩培的醋酸菌借助强大的无菌空气或自吸空气的气流充分搅拌混合，加大了气液混合面积，从而进行全面的酒精氧化，生成质量一致的高酸度食醋。由于反应迅速，短时间内提高了发酵速率和产率，生产周期大大缩短。实际生产证明“液态法”比“固态法”出醋率提高12%，成本下降12%，生产周期由原“固法”的25～27d缩短为5～7d。液态深层发酵实现了制醋生产机械化、管道化，减轻了工人的体力劳动强度，减少了占地面积，广开了原料来源，提高了劳动效率。液态深层发酵是酿造调味品工业的一项革新，但由于酿醋周期短，风味欠佳，作为调味品食醋尚有不足。
液态深层发酵技术酿制的米醋一般利用大米为原料，以α-淀粉酶（液化酶）、β-淀粉酶（糖化酶）分别进行液化和糖化，制备以葡萄糖为主的大米淀粉水解液，加入经扩大的酵母菌，进行酒精发酵，酒精发酵结束后，加入醋酸杆菌进行醋酸发酵，醋酸发酵结束后，经后熟，过滤后经消毒得到成品米醋。
（三）实验装置与材料
1.菌种
（1）酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC1001，中国食品发酵工业研究院。
（2）醋酸杆菌（Acetate bacillary），沪酿1.01（上海市酿造科学研究所）或AS1.41（中国科学院微生物研究所）。
（3）黑曲霉（Aspergillus niger）AS3.4309，中国科学院微生物研究所。
2.主要设备
三角瓶、恒温培养箱、摇床、灭菌设备、超净工作台、恒温水浴锅、电子分析天平、电炉、粉碎机、移液枪、试管、温度计、不锈钢锅、干燥箱、小型发酵罐、pH计、酒精计、磁力搅拌器、滴定管、显微镜、血球计数板、10L发酵罐。
3.主要试剂
酒精、葡萄糖、碳酸钙、氢氧化钠、碘化钾、盐酸，AR级；
酵母膏、琼脂、麦芽浸粉、蛋白胨，BR级；
大米、麸皮、食盐、马铃薯、α-淀粉酶、β-淀粉酶，市售。
4.培养基及其制备
（1）斜面试管培养基
①酵母菌斜面试管培养基
麦芽浸粉1.5g，琼脂2.0g，水100mL，pH6.0，在0.1MPa压力下灭菌20min。
②醋酸杆菌斜面试管培养基
酒精2.0g，葡萄糖1.0g，酵母膏1.0g，碳酸钙1.5g，琼脂2.5g，水100mL，各成分完全溶解后，再添加酒精，在0.1MPa压力下灭菌20min。
③黑曲霉斜面试管培养基：
PDA培养基：马铃薯20.0g，葡萄糖2.0g，琼脂2.0g，水100mL，pH自然，在0.1MPa压力下灭菌20min。
（2）三角瓶种子培养基
①酵母菌种子培养基
麦芽浸粉2.0g，调整pH5.0，在0.1MPa压力下灭菌20min。
②醋酸杆菌种子培养基
酒精4.0g葡萄糖1.0g，酵母膏1.0g，碳酸钙1.5g，水100mL，在0.1MPa压力下灭菌20min。酒精在灭菌后无菌条件下加入。
③黑曲霉种子培养基
麸皮80g，水100mL，拌匀过筛，在300mL的三角瓶内装入30g，在0.1MPa压力下灭菌30min。
（四）实验方法与步骤
1.实验流程
深层液态发酵食醋工艺流程见图1-5-3。
图1-5-3 深层液态发酵食醋工艺流程
2.实验步骤
（1）大米粉碎，调浆
将大米用水浸泡。使米粒充分膨胀，然后将米与水按1∶（1.5～2）的比例均匀送入磨粉机（水磨），磨成70目以上的细度粉浆（浓度为18～20°Bé），加入不锈钢锅内，用Na2CO3调pH至6.2～6.4（精密试纸测定），再加入0.1%的氯化钙，搅拌均匀。
（2）糖化与液化
①酶制剂活化
将液化酶及糖化酶按1∶10的比例加入40℃的温水，在40℃水浴中复水活化60min。
②液化
先在不锈钢锅内加少量底水，升温至85℃（温度按所购酶制剂最适温度调整），再将调好浆的大米粉乳加入不锈钢锅内，同时按酶制剂说明书上标明的量加入活化好的液化酶（一般每克干淀粉约加酶制剂80～100单位），控制浆温85～90℃（温度按所购酶制剂最适温度调整）约15～40min。用碘液检查呈棕黄色，即为液化终点。再升温至100℃，维持10min，灭酶。
③糖化
将液化后的乳浆降温至60～65℃。并用酸调整pH至4.0～4.5，按酶制剂说明书上标明的量加入已活化的糖化酶（一般每克原料100个酶活单位）。保温1～4h，测定糖化过程中的还原糖含量，计算DE值（即还原糖占干物质的质量分数），在DE值最高时终止糖化。
（3）酒精发酵
①酵母菌扩大培养
在无菌操作条件下，将冰箱保藏的酵母菌试管原种画线接入酵母菌斜面试管培养基中，26～28℃置于恒温培养箱恒温培养约3d，当菌落全部长好后备用（4℃冰箱内保存）。从培养好的斜面试管中挑取1～2环接入已灭菌并冷却的三角瓶培养基中，摇匀后，置于26～28℃恒温摇床中160r/min振荡培养，24h后达到酵母生长旺盛期。镜检菌体生长正常、无杂菌，要求酵母细胞数为1×108个以上，出芽率在15%～30%，酵母死亡率＜1%。
②发酵罐空消
发酵罐彻底清洗后，打开排水阀，排尽夹套中的水。同时排尽蒸汽管中冷凝水后，先对空气过滤器进行灭菌，让蒸汽徐徐进入发酵罐；对发酵罐进行空消。在灭菌过程中，应时刻注意罐压，并控制在（0.11～0.12）MPa，请勿超压。罐压的控制通过调节进气阀和排气阀来实现。空消时间一般为30～50min。达到一定时间后，关闭进气阀和排气阀。当罐温降至80℃以下时排尽发酵罐内的冷凝水后。为防止发酵罐内产生负压，必须通入无菌空气，使罐压保持在0.03～0.05MPa。
③酒精发酵
将糖化液加入发酵罐内，装量为发酵罐总体积的60%～70%，将蒸汽通过夹套对发酵罐进行加热，100℃维持30min后，再在夹套内通入冷却水将糖化液的温度降至30℃，关闭门窗、空调，在火焰保护下，按原料的10%接种量加入三角瓶扩大培养的酵母种子液。并开动搅拌（200r/min），按0.5VVM（每min通气量与罐体实际料液体积的比值）通入无菌空气10～15min，使发酵液中的空气饱和，满足酵母菌体细胞生长的需要。然后关闭无菌空气及搅拌，维持温度30～32℃，罐压0.03MPa进行酒精发酵，发酵时间60～72h，酒精度在8%以上结束酒精发酵，接入醋酸杆菌种子液。
（4）醋酸发酵
①醋酸菌扩大培养
在无菌操作的条件下，将冰箱保藏的醋酸菌原菌画线接入醋酸菌斜面试管培养基中，在30～32℃下培养48h，当菌落全部长好后备用（4℃冰箱内保存）。在已长好的试管菌种中加入10mL的无菌水，用接种环将接斜面上的菌体刮到无菌水中，制作成菌体悬液，用5mL移液枪无菌操作下吸取3mL加入醋酸菌三角瓶培养基，摇匀，在32～34℃恒温摇床上180r/min振荡培养24～30h，有醋酸清香，镜检菌体生长正常、无杂菌即可使用。
②醋酸发酵
酒精发酵结束以后，在火焰保护下，发酵罐的接种口，按原料的10%接种量加入三角瓶扩大培养的醋酸种子液。并开动搅拌（200r/min），控制温度30～34℃，最高温度不超过36℃，发酵24h内按0.2VVM通入无菌空气，24h到48h内按0.4VVM通入无菌空气，48h后按0.2VVM通入无菌空气，50～72h内醋酸酸度不再上升结束发酵。
（5）后熟、压榨
①黑曲霉麸曲的制备
将冰箱保藏菌种在超净工作台中接种于黑曲霉试管斜面培养基中，置于30℃下恒温培养箱中恒温培养3～5d，至出现大量的黑色孢子。三角瓶麸皮培养基灭菌后，趁热摇散培养基，冬天冷却至40℃下，夏天冷却至30℃左右，在无菌操作条件下，用接种环挑取已培养好的试管原种中的黑曲霉孢子，接入三角瓶麸皮培养基中，摇匀，30℃下置于恒温培养箱中进行恒温培养。当瓶内曲料稍微结块时，摇瓶将结块摇碎。继续培养，待孢子由黄色变成黑褐色即可使用。
②在醋酸发酵液升温至50～55℃，按1.5%（w/V）比例投入成品麸曲，分别恒温静置培养48h后冷却，通过小型板框压榨机进行压榨，收集流出的清液。
（6）勾兑
调整酸度（以乙酸计）为3.5%，并在醋液中加入1.7%～2.0%的食盐以及1.2%～1.5%的蔗糖，以使米醋的酸味柔和，口味纯正、协调。并依据需要适当添加食用级焦糖色素来进行米醋的勾兑。
（7）灭菌
灭菌温度控制在80℃以上，时间10min。
（五）实验结果与分析
1.糖化过程中DE的变化
表1-5-6 糖化过程中DE的测定结果
2.酒精发酵过程中酒精度、残糖的变化
表1-5-7 酒精发酵过程中酒精度、残糖的测定结果
3.醋酸发酵过程中总酸（以乙酸计）、酒精度、pH值、溶氧等变化
表1-5-8 醋酸发酵过程中的总酸、酒精度、pH值、溶氧测定结果
4.计算原料出醋率
5.成品醋酸主要理化指标及微生物指标
表1-5-9 成品醋中理化及微生物指标
（六）实验注意事项
1.液态深层发酵法生产的米醋因为较短周期与纯种发酵，在风味上较传统固态发酵制备的米醋要显单薄。近年来，用添加麸曲后酵方法来增强、改善米醋风味，丰富口感的工艺得到了一定范围内的应用。其机理大致有两点：①麸曲中黑曲霉合成的酸性蛋白酶能水解醋醪米渣中的蛋白质使氨基态氮增加，从而使口感更柔和、丰富；②麸曲的特殊香味大大增加了米醋的醇厚风味，使成品带有醇厚曲香。
2.液化与糖化及酒精发酵的彻底与否对醋酸发酵影响很大，若液化、糖化阶段未彻底，残留的糊精较多，将不被酵母菌及醋酸杆菌利用，不仅影响原料的转化率，同时会使醋酸发酵产生大量的泡沫，造成溢罐。酒精发酵若未彻底，即残糖值高时就进行醋酸发酵，也会有大量的泡沫产生，造成溢罐。且残糖可能会在后酵阶段的高温下与蛋白质、多酚等物质反应生成不良气味，影响成品风味。因而，酒精发酵一定要在残糖接近0时才能进行醋酸发酵。
3.酵母菌为兼性厌氧菌，在有氧的情况下，酵母菌可进行有氧呼吸（也是主要的细胞呼吸类型），并且繁殖；在缺氧的情况下，酵母菌可进行无氧呼吸，产生酒精。因此，在前期通入无菌空气有利于酵母的快速繁殖，在酒精发酵过程中应停止搅拌及通气。
4.醋酸菌是好气性细菌，因此液态深层培养时必须供给足够的氧气。通风量一般为理论计算需氧量的2.8～3.0倍，发酵前、中、后期可根据发酵实际情况进行调节，但绝不能中断供氧，否则会导致菌体死亡。
5.醋酸发酵过程中产生泡沫是正常现象，主要是由死亡的醋酸杆菌菌体蛋白造成的，如泡沫过多造成溢罐，可使用少量植物油进行消泡。因食醋是直接食品故不允许用化学消泡剂。
参考文献
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（编者：戴德慧）
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