酸奶发酵技术

酸奶发酵技术_生物工艺学实验指

综合实验七　酸奶发酵技术

一、背景知识

（一）酸奶简介

酸奶（Yogurt）是以牛奶为主要原料，利用保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）等微生物，通过乳酸发酵作用而得到的一种发酵型乳制品，其中含有大量的活性乳酸菌。酸奶的营养和保健价值颇高，可增强肠胃的消化功能，促进人体对钙和磷的有效利用，增加肠道有益菌的数量，降低血清中胆固醇含量，预防心血管疾病和抗癌活性。酸奶还可以为乳糖不耐症人群提供消费牛奶的机会。

我国从20世纪80年代初才开始商业化生产酸奶，虽然起步较晚，但我国的酸奶工业发展迅速，目前在大中城市及农村，酸奶的消费已相当普遍，是我国液态奶中发展最快的乳制品之一。酸奶主要分为普通型酸奶、功能型酸奶和风味型酸奶。普通型酸奶在发酵过程中除加入糖外，不再添加任何成分，以保持酸奶的清香味。风味酸奶分为凝固型和搅拌型两种：凝固型风味酸奶是在原料奶中预先添加风味物质，如花生乳、绿豆浆、松仁、玉米乳等，经巴氏杀菌后发酵而成；搅拌型风味酸奶是在乳酸菌发酵原料奶凝固之后，再加入风味物质，如蜂蜜、果酱、果肉、果菜、胡萝卜汁、枸杞子、香料等调制而成。如果添加的天然风味物质具有保健功能，此类酸奶也可称为保健型酸奶或功能型酸奶。

（二）酸奶风味的来源

相比于原料奶，酸奶具有独特的风味和口感，不同类型酸奶中的风味物质的成分及含量因加工工艺和方法的不同而各有特色。酸奶中的风味物质主要来源于原料奶中的组成成分、微生物代谢产物及添加的风味物质。新鲜的牛乳（原料乳）有一股淡淡的奶香味，已确定的香味成分主要有丙酮、乙酸、油酸及其他的游离脂肪酸和挥发性的二甲硫醚等。发酵过程中标准化、均质、加热、杀菌等流程均可引起乳制品风味的变化。链球菌嗜热亚种（Streptococcus thermophilus S.t）和德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus L.b）产生的乳酸及各种挥发性的有机香气物质赋予酸奶典型风味（Mounchili，2005）。酸奶的风味由挥发性和非挥发性风味物质共同组成，挥发性的成分起主要的作用，挥发性成分的浓度决定了最终风味的组成。筛选发酵剂主要测定二丁酮、双乙酰、乙醇、乙酵、丙酮等作为风味的标志性物质，可釆用化学计量学结合感官评价的方法对风味物质进行分析和研究，既能对风味物质进行定量分析，又可防止测定结果对感官评价的偏离。酸奶风味的散发不仅与风味的分布及浓度有关，还与温度、搅拌参数及脂肪含量相关。

二、实验简介

本实验分为两部分，第一部分为酸奶的制作工艺，第二部分为酸奶中乳酸菌种类与含量分析，涵盖了目前市场上以牛奶为原料乳的酸奶的主要生产工艺技术，通过这两部分内容的学习和实践，可为今后从事酸奶的工业发酵生产奠定理论和实践基础。

实验7-1　酸奶的制作

（一）实验目的

1.掌握酸奶的制作原理。

2.学会酸奶的制作方法。

（二）实验原理

酸奶具有清新爽口的味觉，倍受广大消费者欢迎。酸奶中含有乳酸菌的菌体及代谢产物，对肠道内的致病菌有一定的压抑作用，对人体的肠道消化道疾病有良好的治疗效果。

酸奶是以牛乳为主要原料，接入一定量的乳酸菌，经发酵后而制成的一种乳制品，当乳酸菌在牛乳中生长繁殖和产酸至一定程度时，pH下降，使乳酪蛋白在其等电点附近发生凝集而呈凝乳状，这种凝乳状酸奶称为凝固型酸奶。

（三）主要材料及设备

鲜牛奶、奶粉、蔗糖、菌种（或市售酸奶）、天平、烧杯、玻璃棒、牛奶瓶、恒温水浴锅、恒温培养箱、冰箱、不锈钢锅。

（四）实验方法

1.凝固型酸奶制作

在原料乳中添加发酵剂后立即进行包装，并在包装容器中发酵而成，成品呈凝乳状。

（1）工艺流程

（2）操作步骤

①牛奶瓶消毒。

将牛奶瓶在不锈钢锅里用沸水煮15min。

②牛乳的净化。

利用特别设计的离心机，除去牛乳中的白血球和其他肉眼可见的异物。

③脂肪含量标准化。

鲜奶中脂肪含量比较高，为了避免酸奶中有脂肪析出，需要对鲜奶的脂肪含量进行调整使其达到所要求的标准。可以在脂肪含量高的牛乳中加入一定量的脱脂乳，或通过分离机从牛乳中分离出稀奶油，然后在得到的脱脂乳中再掺入一定量稀奶油，使调制乳的脂肪含量达到要求。

④配料。

奶粉的添加。经脂肪含量标准化处理的调制乳（或按1∶7的比例加水把奶粉配制成复原牛奶），为了使其非脂干物质含量达到要求，一般往调制乳中添加脱脂奶粉，经如此处理的酸奶有一定的硬度，脱脂奶粉的添加量一般为1%～3%。

蔗糖的添加。为了缓和酸奶的酸味，改善酸奶的口味，一般在调制乳中加入4%～8%的蔗糖。如果蔗糖量加入过多，会因调制乳渗透压的增加而阻碍乳酸菌生长。一般是先将原料乳加热到60℃左右，然后加入蔗糖，待糖溶解后，过滤除杂，过滤的奶液再进行均质处理。

⑤均质。

用于制作酸奶的原料乳一般都要进行均质处理。经过均质处理，乳脂肪被充分分散，酸奶不会发生脂肪上浮现象，酸奶的硬度和黏度都有所提高，而且酸奶口感细腻，更易被消化吸收。将加热和均质两种方法适当结合起来处理的效果会更好。一般是先将原料乳调至60℃左右，然后在均质机中，于8～10MPa压力对乳进行均质处理。

⑥灭菌。

均质后的原料乳的灭菌方法大致有两种：将乳加热至90℃，保温5min，或置于80℃恒温水浴锅中灭菌15min；也可用超高温瞬时灭菌法（在135℃下保温2～3s）。

灭菌目的：杀灭原料乳中的微生物，特别是致病菌；形成乳酸菌生长促进物质，破坏乳中存在的阻碍乳酸菌生长的物质；除去原料乳中的氧及由于乳清蛋白的变性而增加的-SH，从而使氧化还原电位下降，有助乳酸菌的生长；使乳清蛋白变性膨润，从而改善酸奶的硬度和黏度，并阻止水分从变性脂蛋白凝聚成的网状结构中分离出来；灭菌后，使乳中原本存在的酶失活，使发酵过程成为单一乳酸菌的作用过程，易于控制生产；经灭菌处理后的原料乳迅速冷却到43～45℃待接种。

⑦接种。

在43～45℃灭过菌的原料乳中加入发酵剂，接种量为2%～3%，通常是嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的混合菌，两种菌的比例为1∶1或2∶1。球菌的接种量稍多些，可弥补由于杆菌生长产酸而阻碍球菌生长所造成的球菌数量不足的缺点。经实验证明，当接种量超3%时，发酵所需时间并不因种量加大而缩短，而酸奶的风味由于发酵前期酸度上升太快反而变差。所以，任意加大接种量是无益的，反之，若接种量过小，发酵所需时间延长，酸奶的酸味会显得不够。

⑧分装。

酸奶受到振动，凝乳状态易被破坏，因此，不能在发酵罐中先发酵然后再进行分装。分装必须是将含有乳酸菌的牛乳培养基先分装到销售用的玻璃瓶或塑料小容器中，加盖后送入恒温室培养，在容器中发酵制成酸奶，为了避免杂菌的侵入，分装操作应在无菌室中进行。牛乳分装后，容器上部留出的空隙要尽可能小，这样容器中的内容物晃动幅度小，酸奶的形态易保持完整。另外，减少空气也有利于乳酸菌的生长。整个分装操作的时间要短，使乳液温度下降少，这样乳液温度与所设定的发酵温度接近，整个发酵时间就不会被延长。

⑨发酵。

将装有含乳酸菌的牛乳的容器置于恒温箱中进行发酵，恒温箱的温度保持在40～43℃，时间为3～4h；或30℃培养18～20h。

发酵终点的确定有两种方法：发酵奶的酸度已达到65～70oT［用0.1mo L/L NaOH标准溶液滴定10mL样品，每消耗掉1mLNaOH溶液称为1滴定酸度（oT）］，或pH＝4～5；发酵奶的流动性变差，基本凝固。

⑩冷却。

发酵结束，在将酸奶移放进冷藏室进行贮存和后熟处理之前，应将酸奶从发酵室中取出，用冷风迅速将其冷却到10℃以下，使酸奶中的乳酸菌停止生长，防止酸奶酸度过高而影响口感。

后熟。

酸奶在形成凝块后应在4～7℃下保持24h以上，以获得酸奶特有风味和较好口感。

冷藏。

经冷却处理的酸奶贮藏在2～5℃，最好是-1～0℃的冷藏室保存。

低温保存有以下优点：保存期间酸奶的酸度上升极少；牛乳凝固时会产生收缩力，导致乳清析出，在低温时这种收缩力比较弱，所以乳清不易从酸奶中分离出来；低温下酸奶逐渐形成白玉般的组织状态，结构非常细腻；低温保存过程中，香味物质逐渐形成，使酸奶具有较浓香味。

品味。

酸奶应有凝块，质地细腻、酸甜适中、清新爽口，若有不良异味，则很可能是酸奶污染了杂菌。

（五）实验注意事项

选择优质、新鲜的牛奶和酸奶（作为菌种）。

严格无菌操作，尽量避免杂菌污染。

酸奶制好后，应在0～5℃下保藏，保质期为5d。

附：原料奶质量要求

1.来源于健康牛所产的乳，色泽呈乳白色或微黄色，气味芳香、无异味。初乳、末乳、细菌污染乳均不得使用。

2.乳牛注射抗生素后所产出乳，4d内不得使用。生产前应做小样试验。

3.总乳固体不低于11.5%，非脂乳固体大于8.5%。

4.原料中不得含碱及菌剂等杂质。

5.奶温不高于10℃，70度酒精试验无絮状物沉淀。

酸奶卫生标准

1.感官指标

呈乳白色或稍带淡黄色，具有清香纯净的乳酸味，凝块稠密、结实、均匀，无气泡，允许少量乳清析出。

2.理化指标

3.细菌指标

实验7-2　酸奶中乳酸菌种类与含量分析

益生菌是一种通过改善肠道微生物平衡，从而对宿主施加有益作用的微生物，它们对人体机体有其他多种菌群无法起到的生理调节作用。其主要功效有：调节人体肠道菌群平衡，促进胃肠蠕动，防止便秘，帮助消化；改善和提高自然免疫功能（抑制癌症细胞）；抗过敏；处理乳糖不耐症；供应人体健康所必需的氨基酸及维生素B；抑制致癌物质及其他有害微生物的形成；促进体内有益菌的生长；降低血脂和高血压；延缓老化。在我国市场上生产销售的各种酸奶制品中，作为益生菌添加的乳酸菌，通常为保加利亚乳杆菌和嗜热乳酸链球菌，近年来双歧杆菌和嗜酸乳杆菌等也被广泛使用。乳酸菌活菌体需达到一定数量，才有可能到达并定植在人体肠道内，抑制有害菌的增殖和活动，维持肠道的微生态平衡，增进人体的健康。对这类产品质量检测时进行活菌计数，即用乳酸菌数量来评价活性乳酸菌制品的质量显得尤为重要。食品安全国家标准（GB 19302-2010）对发酵乳亦做出相关规定，乳酸菌数不得低于1×106CFU/mL。可见，酸奶中乳酸菌数量已正式成为评价酸奶质量的一项重要指标。

目前市场上销售的酵奶制品，主要是由双歧杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌等菌群共同发酵而成的，酸度与风味和质量变化是息息相关的。

由于乳酸菌对营养有复杂的要求，生长需要碳水化合物、氨基酸、肽类、脂肪酸、酯类、核酸衍生物、维生素和矿物质等，一般的肉汤培养基难以满足其要求。测定乳酸菌时必须尽量将试样中所有活的乳酸菌检测出来。要提高检出率，关键是选用特定良好的培养基。采用稀释平板菌落计数法，检测酸奶中的各种乳酸菌可获得满意的结果。

（一）试剂材料

1.培养基

MRS培养基和MC培养基。

2.主要试剂

葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、柠檬酸钠、磷酸氢二钾、乙酸钠、mgSO4· 7H2O、MnSO4·4H2O、吐温-80、琼脂粉、氯化钠、革兰氏染色液、甲基红试剂、3%过氧化氢、吲哚试剂、固体石蜡、氢氧化钠等。

3.仪器和器具

无菌移液管（25mL，1mL），无菌水（225mL带玻璃珠三角瓶，9mL试管），无菌培养皿，旋涡均匀器，恒温培养箱。

（二）实验方法

1.酸奶中不同益生菌的分离、鉴定

将酸奶画线接种于MRS琼脂平板和MC琼脂平板中，37℃下厌氧培养。48h后挑取不同特征的代表性菌落，革兰氏染色镜检，观察染色反应及形态特征。对两种培养基中不同特征的菌落接种与乳酸菌微量生化管，24～48h内观察生化反应结果。根据形态、染色结果及生化反应结果判定益生菌的类型。

2.活性乳酸菌菌落计数

参考食品安全国家标准《食品微生物学检验　双歧杆菌的鉴定》（GB4789.34—2012，见附录4）和《食品微生物学检验　乳酸菌检验》（GB 4789.35—2010，见附录5）的方法进行检测。

将酸奶用无菌生理盐水稀释成不同梯度，取1mL倾注平板法接种于MRS琼脂平板和MC琼脂平板中，37℃下厌氧培养48h，实验取3个连续浓度，3个平行，以加1mL无菌生理盐水为空白对照。根据表1-7-1的结果，对不同益生菌种类进行计数。

3.酸奶的pH值及酸度测定

参考国家标准《乳与乳制品卫生标准的分析方法》（GB/T 5009.46—2003）。

用211型pH计直接测定待测酸奶的pH值，用标定后的0.1mol/L的NaOH溶液滴定，测定出酸奶的酸度值，酸度（°T）度数是以酚酞作指示剂，中和100mL酸奶所需氢氧化钠标准滴定溶液（0.1mol/L）的毫升数。

吸取10mL酸奶，置于250mL的三角瓶中，加入20mL水，再加入0.5mL的0.5%酚酞乙醇溶液，小心摇匀，用氢氧化钠标准溶液滴定到微红色，在1min内不消失为测定终点（终点用0.005%碱性品红溶液作对照）。

式中：VNaOH—消耗的氢氧化钠标准溶液的毫升数，mL；

　　　V1—空白溶液消耗的氢氧化钠标准溶液的毫升数，mL；

　　　cNaOH—标准氢氧化钠溶液的浓度，mol/L。

（三）实验结果

1.乳酸菌分离结果

表1-7-1　酸奶中乳酸菌的菌落特征及菌体形态

2.生理生化实验结果

将表1-7-1中的不同菌落分别接种不同的微量生化管，实验设3个重复。

表1-7-2　生化实验结果

3.不同工艺酸奶的口感、酸度等结果

分析接种量、培养时间、加糖量对酸奶口感、酸度、风味和品质的影响

（四）讨论

1.综合评价制作酸奶的品质，说说你的体会。

2.分离和鉴定酸奶乳酸菌过程中的注意事项。

参考文献

［1］Mounchili A，Wichtel J J，Bosset J O，et al.HS-SPME gas chromatographic characterization of volatile［J］.International Dairy Journal，2005（12）.

（编者：高永生）