平菇多糖制备技术

平菇多糖制备技术_生物工艺学实验指

综合实验十　平菇多糖制备技术

一、背景知识

（一）食用菌的应用价值

食用菌具有低脂肪、低热量、多药效、口感滑腻和味道鲜美的特点，富含蛋白质、多种维生素、矿物质和膳食纤维，自古被视为“山珍”。中国的各大传统菜系中，都有用食用菌烹调的名馔佳肴。国外科学家对食用菌的营养和保健功效给予了很高的评价，认为菇类具备了食品的一切良好特性。食用菌生产过程很少喷施农药和使用化肥，是绿色有机食品的典范。在美国，食用菌被称为“上帝食品”；在日本，食用菌被称为“植物性食品的顶峰”；在欧洲，食用菌则有“蔬菜皇后”“植物肉”“素中之荤”之美誉。食用菌被营养学家认定为世界十大健康食品之一。中国为世界第一大食药用真菌生产国，食用菌产业地位仅次于粮、棉、油、果和蔬菜，位居第六。随着人们对食用菌营养价值和药用价值认识的提高以及食用菌生产所带来的经济效益的增加，人们对食用菌产业化技术的研发重视程度越来越高。国内大量栽培的品种只占我国已发现品种中的3%，90%多的野生品种还没有在生产中得到利用。因此，人工驯化培育优质高产、生长迅速、质嫩味美、经济价值高、具有特色的野生食用菌品种，是目前食用菌生产上急需解决的问题。随着科学的进步，逐步由野生驯化成为现代人工大量栽培的各种不同特色的食用菌，成为食用菌科技工作者关注的热点之一。

（二）平菇种质资源

目前我国引进和驯化栽培成功的食用菌品种已达80多种，由于平菇具有栽培方法简单、成本低和产量高等特点，又富含多种氨基酸、维生素和矿物质，是目前我国产量最高的食用菌种类，占我国食用菌总产量24%左右，是极具开发潜力和应用前景的药食两用真菌。平菇是隶属于担子菌门（Basidiomycota）层菌纲（Hymenomycetes）伞菌目（Agaricales）侧耳科（Pleurotaceae）侧耳属（Pleurotus）食用菌共用的商品名称。平菇与其他栽培食用菌不同，它不是分类学上的单一物种，而是由糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）、佛罗里达侧耳（Pleurotus f lorida）、肺形侧耳（Pleurotus pulmonarius）和白黄侧耳（Pleurotus cornucopiae）4个形态特征和栽培特性都十分相似的近缘种组成的族群。糙皮侧耳俗称冻菇、北风菇、蚝菇等，已有人将糙皮侧耳称为平菇，在我国分布广泛，该品种栽培种质丰富多样，子实体一般呈覆瓦状丛生，菌盖色泽上有深灰、浅灰、棕灰之别，质地上有疏松、脆嫩、紧实等不同，菌柄一般为侧生或偏生。由于多年的人工选择、引种和交流，目前栽培品种多达数十个。白黄侧耳栽培品种俗称姬菇、小平菇，子实体外观与糙皮侧耳相似，子实体密集丛生、菌盖较小，菌盖颜色为深灰色至浅灰色。肺形侧耳的栽培品种多指凤尾菇和秀珍菇，子实体形态呈单生或散生，菌盖成熟后期边缘常呈波状，菌柄多侧生。其中秀珍菇因其质地致密、口感滑爽、清香、耐储性好深受消费者喜爱。佛罗里达侧耳栽培品种俗称白平菇或高温白平菇，最早是由国外引进，该品种特点为子实体呈放射状丛散生，色泽为乳白色或深些。

平菇菌丝在2～40℃均可生长，环境温度在24～28℃最适宜其生长。子实体形成温度范围因品种的感温性差异而有所不同。平菇喜湿，好偏酸性生长环境，菌丝生长阶段的最适湿度为60%～70%，原基分化和子实体发育时最适空气湿度为85%～95%。平菇菌丝在pH值为4～8时均能生长，最适pH为5.8～6.2。当pH超过8时，菌丝生长速度明显下降并趋于停止。当pH降至4以下时，菌丝生长也会受到明显的抑制。子实体发育的最适pH值为5.5～6.0。平菇属于木腐性真菌，对营养的适应范围广，要求不太严格，许多富含纤维素的农副产品下脚料均可作为生长基质，生产上常以秸秆、玉米芯、棉籽壳、木屑等作为栽培原料。平菇栽培季节主要为春秋两季，目前一些新品种也可夏季种植，通过人工控制环境的温度、湿度，亦可全年工厂化种植。栽培基质可采用生料或发酵料，可利用床栽、畦栽、袋栽、瓶栽等方式进行种植。

（三）平菇多糖的保健作用

我国是最早将真菌应用于药用或养生保健领域的国家之一，春秋战国时代起就有多种文献和典籍记载真菌多糖的药用和保健功效。平菇在全世界约有50种，我国是平菇种类资源较为丰富的国家之一，目前野生和引种的栽培品种已达56种，我国平菇产量占世界总产量的25%左右。平菇是目前产量最高、人工栽培最广泛、与人类关系最为密切的食用真菌之一，是具有较高营养价值和药食兼用价值的真菌。平菇的优点主要体现在易于栽培、产量高、生产成本低、种植经济效益较高。平菇含丰富的多糖、氨基酸、微量元素、多种脂肪酸、三萜等营养生理活性成分，平菇多糖（Pleurotus ostreatus polysaccharide，POP）是从平菇中提取的一种重要成分，生理功能十分广泛，具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖、降血压、降血脂、抗衰老、抗氧化、抗辐射等多种药理和保健功效。利用发酵技术可以在很短时间内获得大量富含活性多糖的平菇菌丝体，并从菌丝体中提取多糖。平菇多糖的研究也较为广泛，在保健食品和功能性食品开发方面应用广泛，可有效增强人体免疫力，提高机体抗病能力，并对疾病的治疗起到很好的辅助功效。近年来世界各国都开始重视真菌多糖的医疗和保健作用，将真菌多糖视为21世纪的食品。有专家预言：“在生化和药物领域中，兴师动众的蛋白质时代即将过去，取而代之的将是多糖时代”。食药用真菌多糖在国际上被称为“生物反应调节物”（Biological Response Modifier，BRM）。

（四）平菇多糖的药理功效

1.平菇多糖的抗肿瘤作用

大多数真菌多糖，如云芝多糖、灵芝多糖、香菇多糖、黑木耳多糖、金针菇多糖、猪苓多糖、茯苓多糖、黄蘑多糖等，都具有确切的抗肿瘤活性，临床上可用于治疗多种肿瘤，其治疗效果显著。真菌多糖抗肿瘤作用机理目前尚无定论，主要是通过增强和恢复患者的免疫功能来实现其抗肿瘤作用，并且对人体无毒副作用。真菌多糖的抗肿瘤机理主要包括以下方面：促进抗体形成，刺激或协助恢复T细胞，提高淋巴细胞转化率，激活巨噬细胞，诱生干扰素抑制肿瘤，增加细胞中c AMP浓度，提高血清或血浆蛋白含量，升高白细胞数等。平菇含有菌糖和甘露醇糖等多种生物活性物质，以发挥抗肿瘤、抗病毒的功效，抑制病毒素的合成和增殖。

2.平菇多糖的免疫调节作用

平菇多糖的生物活性中最主要的是免疫调节活性，作为一种免疫调节剂的真菌多糖被广泛用于免疫性缺陷疾病、自身免疫疾病和肿瘤等的临床治疗，可通过多条途径、多个层面对免疫系统发挥调节作用。通过激活机体的T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞（NK）等免疫细胞，广泛刺激机体的特异性与非特异性免疫反应，改善机体免疫系统功能，提高机体免疫力，从而起到“扶正固本”的作用。近年来一些具有增强机体的免疫作用的真菌多糖相继被发现，如黄蘑多糖、银耳多糖、香菇多糖、灵芝多糖等。研究还显示，平菇多糖中的葡聚糖和虎奶多糖也具有提高人体免疫力的功能。

3.平菇多糖的降血糖作用

真菌多糖能有效增强冠状动脉机能，扩大冠体流量，增强心肌供氧能力，降血脂，预防动脉硬化，改善血液循环，在降低血糖、血脂和血压等方面都有显著作用。当今国内外对平菇多糖的降血糖作用及其机制进行了深入研究，证实平菇多糖具有良好的降血糖功效，可通过不同途径发挥降血糖作用。真菌多糖降血糖的机制主要包括：促进胰岛素分泌，增加血清胰岛素含量，改善胰岛素抵抗，加速肝葡萄糖代谢，减少或减缓对葡萄糖的吸收。迄今已发现不少药用真菌多糖均有降血糖作用，如云芝、灵芝、虫草、银耳、白木耳、黑木耳、猴头、灰树花、蜜环菌和金耳等多糖，食用上述真菌多糖能通过增加胰岛素的分泌量、提高胰岛素的利用率而降低糖尿病患者的血糖水平，对糖尿病患者健康是有益的。

4.平菇多糖的降血脂作用

研究显示，平菇多糖能够通过防止机体脂质过氧化损伤而发挥其降血脂的功效，平菇中的糙皮侧耳具有降脂功效已被实验证实，糙皮侧耳中起降血脂作用的活性物质是Mevinolin。许多真菌中含有降血脂活性成分——洛伐他汀、齐放等，在侧耳属的长柄侧耳中发现了降血脂成分——洛伐他汀，金顶侧耳甲醇提取物具有显著的降血脂活性，研究证实金顶侧耳中也有洛伐他汀的存在。

5.平菇多糖其他药理作用

平菇多糖的药理作用还表现在抗氧化、抗衰老和清除自由基的生理作用。研究还发现，平菇真菌多糖具有抗病毒、抗凝血、抑菌和保肝护肝等生物功效，如虎奶菌多糖对动物的肝脏具有保护作用，对网状皮系统也有兴奋功能。平菇多糖还具调节自主神经功能，特别是对更年期综合征有明显调节作用，糙皮侧耳子实体壳聚糖具有较高的抑菌杀菌能力。平菇已成为食品和药品开发的重要资源之一，其表现出的广泛的营养价值、保健和抗病活性已成为食品工业和医药界关注的热点。

二、实验简介

随着食用菌液体菌种深层发酵技术的兴起，利用深层液体发酵技术对菌种进行培养，然后再进行人工或自动化接种进行固体栽培，或直接从菌丝体中提取具有生物活性的物质已经成为行业热点。与固体发酵生产食用菌子实体相比，食用菌的液体深层发酵进行菌种培养具有如下优势：

（1）生产周期大大缩短，生产管理更规范；

（2）利用液体种子代替固体种子，菌龄一致性更高，接种更方便，便于自动化生产；

（3）便于通过代谢调控，大量获得所需的次生代谢产物，产率和生产效率更高。一些尚不能人工栽培的野生菌（比如冬虫夏草）可通过液体深层发酵获得目的产品或特定活性物质，便于工业化量产，已有50余种食药用真菌可采用深层发酵技术进行培养。

利用深层液体发酵技术进行平菇的生产，生产效率更高，更容易进行工业化和规模化生产，也是平菇生产的发展趋势。如果利用液体深层发酵技术培养平菇是为了栽培获得子实体，则液体发酵结束后短时间内在无菌条件下接种并进行固体栽培即可。如为获得平菇多糖（或其他代谢物质），可将深层发酵培养获得的平菇菌丝体，经过过滤、离心、真空蒸发、沉淀、吸附、干燥等处理工序，将多糖产物浓缩获得粗多糖，也可进一步纯化为商品。

本实验分为三部分，第一部分为平菇液态发酵培养条件的确定；第二部分为平菇液态培养的结果分析和测定；第三部分小型发酵罐中进行产品的分批发酵。这三部分的实验内容涵盖了平菇液体发酵工艺条件的确定方法、发酵产物——多糖的测定、小型发酵罐的使用方法及利用小型发酵罐对平菇进行分批发酵的工艺操作。通过这三部分内容的学习和实践，可为今后利用发酵罐对食用菌进行深层液体发酵工业化生产奠定理论和实践基础。

实验10-1　平菇液态发酵培养条件的确定

平菇常规固体菌种培养生产周期长、菌龄不一致，容易带来菌种质量不高，且生产效率较低的问题。液体发酵培养技术可大大缩短原种或栽培种的制种时间，提高菌种的均一性和生产效率。在液体培养中，菌丝体新陈代谢旺盛，菌丝生长分裂迅速，能在短时间内产生大量的菌丝体（菌种），液体菌种接入固体培养料时，又具有流动快、易分散、萌发快、发菌点多等特点。菌种可进行自动化、工业化和规模化生产，生产周期短，菌龄整齐。平菇多糖等代谢物质亦可从液体发酵培养的菌丝体里面直接分离纯化。发展平菇液体培养技术前景广阔。

（一）实验目的

1.掌握微生物斜面培养基、种子培养基及发酵培养基确定方法，学会对已知菌种确定实验室发酵工艺。

2.筛选平菇最适生长及产物形成的营养条件和培养条件，确定特定产物发酵的最适工艺参数。

（二）实验材料

1.菌种

平菇（Pleurotus ostreatus）。

2.仪器设备

天平、电炉、烘箱、恒温振荡培养箱。

3.玻璃仪器

三角瓶（棉塞）、接种铲、试管菌种、烧杯500mL、量筒100mL等。

4.培养基原料

土豆、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、玉米粉、琼脂、KH2PO4、mgSO4、CaCl2、维生素B1等。

（三）实验方法与步骤

1.培养基配置（正交试验设计——培养基成分）

2.接种

3.培养（正交试验设计——培养条件确定）

4.结果观察、检测

菌丝球直径、菌丝体积、生物量——比浊法和直接称重法、总糖、还原糖的测定等。

表1-10-1　培养基正交试验因子水平

表1-10-2　正交试验方案与结果

表1-10-3　培养条件正交试验因子水平

表1-10-4　正交实验方案与结果

（四）实验结果与分析

1.如何通过设计正交试验确定食用菌液态发酵的培养条件。

2.根据所查资料说明接种量、装液量、温度和振荡速度对培养结果的影响。

实验10-2　平菇液态培养的结果分析和测定

（一）实验目的

1.学习液态培养结果观察。

2.掌握丝状真菌液态培养的生物量的测定和总糖、还原糖的测定方法。

（二）实验材料

1.仪器设备

天平、电炉、烘箱、紫外分光光度计、离心机。

2.玻璃仪器及其他

平菇培养摇瓶种子、接种铲、表面皿、洗瓶、刻度离心管、刻度尺等。

（三）实验方法与步骤

1.菌丝球直径和菌丝体体积的测量

直径：由刻度尺直接测得；体积：用刻度离心管离心后测得。

2.生物量的测定

（1）原理

生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。酵母在液体深层通气发酵过程中是以均一浑浊液的状态存在的，可以采用直接比色法进行测定。而丝状真菌则一般用直接称重法测定其生物量。

（2）实验步骤

取发酵液在3000r/min离心10min，弃上清液。水洗，离心10min，沉淀称湿重和干重。

（四）多糖的测定——苯酚-硫酸法

1.原　理

此法通过制备显色溶液在紫外分光光度计上进行光度测定。苯酚-硫酸为此法中所用到的试剂，另外还包括葡萄糖溶液（作标液）、样品（作样品液）、乙醇（使多糖沉淀）。

食品中分子量＞10000的高分子物质（多糖）在80%乙醇溶液中沉淀，与水溶性单糖和低聚糖分离，粗多糖在硫酸的作用下水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，与苯酚缩合成有色化合物，用分光光度法测定样品粗多糖含量。

2.实验步骤

（1）标准曲线的制作

①标准液制备

精密吸取葡萄糖标准使用溶液（40mg/L）0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0mL分别置于0号、1号、2号、3号、4号、5号、6号、7号试管中，加蒸馏水到2mL，各加入苯酚溶液1.0mL，在旋转混匀器上混匀，在冰水浴中小心加入浓硫酸5.0mL，于旋转混匀器小心混匀，置沸水浴中煮沸10min，冷却后用分光光度计在490nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。

②标准曲线的制作

以0号管为空白，在分光光度计上测定1—7号管的吸光度值。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。

表1-10-5　苯酚-硫酸法标准曲线制作参考表

（2）样品液制备

①提取

精密称取混合均匀的含粗多糖样品4.0g，置于100mL容量瓶中，加水80mL左右，于沸水浴上加热2h，冷却至室温后补加水至刻度，混匀、过滤，滤液供沉淀多糖。

②沉淀粗多糖

精密取液体样品5.0mL（即被测多糖是液体而不是固体样品）置于50mL离心管中，加入无水乙醇至90%，混匀后以4000r/min离心10min，弃去上清液。沉淀后用80%乙醇溶液数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复3～4次操作。接下来沉淀，用水溶解并定容至50mL，混匀后供沉淀葡聚糖。

③测定

精密取样品测定液2.0mL置于25mL比色管中，加入苯酚溶液1.0mL，在旋转混合器上混匀后，在冰水浴中小心加入浓硫酸5.0mL后于旋转混合器上混匀后，置于水浴中煮沸10min，冷却至室温，用分光光度计在490nm波长处，以试剂空白为参比，1cm比色皿测定吸光度值。

以上步骤必须做3个重复。

（3）计算

取样品液中3个重复的平均吸光度值在标准曲线上查标准曲线，计算出相应的葡萄糖毫克数，可求出发酵液中总多糖的含量。

（五）实验结果与分析

1.比较平菇静置培养和摇瓶培养的菌丝球直径和生物量的变化，试分析产生其变化的可能的原因。

2.结合实验一，谈谈平菇液态培养的体会，分析实验成功或失败的原因和收获。

实验10-3　小型发酵罐中平菇的分批发酵

发酵罐（生物反应器）是发酵工程的重要组成部分，是利用发酵技术将原料转化为产品的关键设备，在发酵工程中处于中心地位。机械搅拌式发酵罐，是进行液体发酵的特殊设备。实验室使用的小型发酵罐，其容积可从1L至数百升。一般来说，10L以下的发酵罐是用耐压玻璃制作的罐体，10L以上用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备有控制器和各种电极，可以自动调控试验所需的培养条件，是微生物学、遗传工程和医药工业等科学研究所必需的设备。

（一）实验目的

1.认识发酵罐的结构与功能，反应前的安装和准备，反应后的拆卸和清洗等。

2.分别了解pH电极和溶氧电极（DO）的结构和基本原理；掌握pH电极和溶氧电极的校正方法。

3.掌握发酵罐培养基的在位灭菌与离位灭菌；认识反应器在位高压灭菌的方法和规程，学会对反应器培养液灭菌过程中的升温、保压、降温和培养温度的设定等的操作。

4.掌握发酵罐接种的方法及操作流程，确保发酵液无杂菌污染；掌握pH调节剂和消泡剂的流加方法。

5.学会从发酵罐中定时取出样液的方法。并掌握正确使用发酵罐发酵生产的方法，从而可对中试及中试以上的发酵生产研究有一个初步的概念和感性认识。

6.根据微生物生长的基本特点，引导学生对从菌体萌发到衰亡的整个生长过程有一个全面实际的认识，并在此基础上测绘菌体的生长曲线，同时根据测绘结果，计算对数生长期的比生长速率。

7.了解测定生物量的基本方法（细胞计数法、生物量湿重法和干重法、浊度测定法、离心压缩细胞体积法）。

（二）实验原理

图1-10-1　BIOF6010微生物发酵罐

各厂家生产的发酵罐会有所差别，但基本原理是相同的。现以上海理工大学出厂的5L罐为例，说明小型发酵罐的结构。发酵罐的结构可分为罐体和控制器两部分，如图1-10-1。

发酵实验的正常运行需要三部分结构，分别为：罐体和控制箱、空气压缩机（空压站）和蒸汽发生器（锅炉房），这里主要介绍罐体和控制箱。

罐体为一硬质玻璃圆筒，底和顶两端用不锈钢板及橡胶垫圈密封构成，容积为5L，顶盖上有几个孔口（如图1-10-2），分别是加料及接种口、放置温度计口、补料口、放置DO（溶解氧）氧电极口、放置温度电极口、放置pH电极口、放置消泡电极口、放置取样管口、放置搅拌器及冷凝管口。

图1-10-2　发酵罐顶盖及各孔口

1.加料及接种口；2.放置温度计口；3.补料口；4.放置DO（溶解氧）电极口；5.放置温度电极口；6.放置pH电极口；7.放置消泡电极口；8.放置取样管口；9.放置搅拌器及冷凝管口

发酵罐放置在罐座上，罐座除支持发酵罐外，还有搅拌器转动装置、升温和冷却装置等。

控制器能够完成基本的控制功能，它由下列几部分构成：

（1）参数输入及显示装置：用于输入控制发酵条件的各种参数及显示发酵过程中罐内培养液的温度、pH、DO（溶解氧）的测定数值。

（2）电极校正装置：用以校正pH电极和DO电极等。

（3）酸碱泵：用以向发酵罐加入酸液（或生理酸性物质）、碱液（或生理碱性物质）以调节培养液中的pH。

（4）消泡剂加入泵：用于向发酵罐加入消泡剂，以消除发酵过程中产生的过多泡沫。

（5）报警及蜂音器按钮：当发酵过程中电路发生故障时，如显示屏上显示温度、转速或DO值超出本机的设定值，则显示屏上的相应值闪烁，并发出“嘟、嘟”声。按此按钮则“嘟、嘟”声可暂时消除，但只有当故障排除，蜂音器才能停止报警。

（6）自动或人工控制按钮：用以决定本控制器是处在自动控制或人工控制状态。

（7）电极电导连线：本机有8条连接导线，分别连接控制发酵罐的DO、pH、温度、泡沫、转速、电机启动、加热和冷却。

（8）空气调节装置：控制器的空气调节装置由进气口、出气口、空气减压阀、空气压力表、空气流量调节阀和空气流量计组成，用以调节进入发酵罐的空气流量及压力。进气管与空气压缩机或氧气瓶相连；出气管与发酵罐之间接有空气过滤器，以滤除空气中的微生物，避免染菌。

（三）实验材料

1.菌种

平菇（Pleurotus ostreatus）。

2.培养基

（1）斜面培养基

马铃薯葡萄糖培养基（PDA）（g/L），马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，自然pH值。

（2）种子培养基（g/L）

①马铃薯200g，葡萄糖20g，自然pH值。

②葡萄糖15g，蛋白胨5g，mgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO41g，酵母粉2g，pH 5.0。

③马铃薯20g，葡萄糖2g，KH2PO40.3g，mgSO4·7H2O 0.15g，pH 5.5，VB0.05%～0.1%。

（3）发酵培养基（%）

玉米粉1g，葡萄糖2g，酵母粉0.5g，mgSO4·7H2O 0.15g，KH2PO4· 3H2O 0.15g，pH 5.0～6.0。

（四）实验材料

BIOF6010型发酵罐。

（五）实验方法与步骤

1.菌种准备

配制PDA培养基100mL，分装试管，灭菌后摆成斜面。将平菇接种于斜面上，28℃培养72h。

2.液体深层培养

选用菌种，经试管斜面活化培养，接种于含100mL液体培养基的250mL三角瓶，28℃培养3d。移接于含200mL液体培养基的500mL三角瓶，28℃培养2d。然后，按10%的接种量移接于装有3.5L液体培养基的磁力搅拌发酵罐，连续通风搅拌培养6d。放罐后，离心分离得菌丝体和发酵液。

3.发酵条件

以正交试验确定的培养基作为发酵培养基，装料系数为0.7，接种量为10%，培养温度为28℃，pH为5.0～6.0，通气量为1∶1，溶氧控制在饱和度的10%以上。

（1）上罐前的准备

①发酵罐的清洗

洗净发酵罐及各个部件，洗净各连接胶管。发酵罐内（可进行清洗）任何部分都应认真清洗，否则都可能成为杂菌的滋生地。发酵前期引起染菌的主要原因是清洗不净。易被忽略而未能充分清洗的地方有轴封、罐顶、取样管和空气分布器等处。另外，还应充分注意发酵罐周围的附件设备，如加热电器、空气压缩机、电机的安全使用。

②上罐前的各项检查工作

检查空气源，排油；防油进空气过滤器造成堵塞。

检查管道阀门（加棉团吸油）校检空气减压阀，pH和DO电极，检查轴封。

③培养基灭菌

配制培养基2000mL，置发酵罐内，调整pH为6.0，加消泡剂豆油0.2%～2%，121℃30min灭菌。灭菌后取出置无菌室中。

（2）上罐时的操作步骤

①把发酵罐置罐座上，连接各电极导线。

②接通控制器、参数输入及显示装置、电极校正装置及罐座电源。

③按控制器、参数输入与显示装置上的AUTO键，使发酵罐处在自动控制状态。

④连接压缩空气管路，接通空气压缩机电源，调节贮气罐出气压力为0.5～1.0MPa，通入压缩空气，调节空气流量计旋钮，使浮子悬浮在5～7L/min处。

⑤调节搅拌转速为250r/min。

⑥连接冷却水管路，打开自来水龙头，通入冷却水。

⑦输入各控制参数，本机自动控制发酵过程中的温度、pH及显示DO值。控制参数的输入是通过参数输入及显示装置进行的。

⑧当发酵罐的温度达到28～30℃时，进行接种。

将酒精置接种口环内，点燃，进行无菌接种，接入种子。密封接种口。接种后立即进行第一次取样。

⑨在搅拌转速300r/min和空气流量在7mL/min下校正DO至100%。

（3）发酵过程各指标的测定

发酵12h后，进行第二次取样。此后，每隔6h进行一次取样。

每次取样检测的指标有生物量、还原糖、蛋白酶酶活、氨基态氮。

每2h采样，作固定片结晶紫染色，镜检，观察是否染菌。早期染菌则提前放罐。

（4）放罐

经过发酵48h后，发酵液基本澄清，菌量增长缓慢，便可放罐。发酵液经离心后，收集发酵液作进一步处理。

（5）清洗

①放罐后，向发酵罐内加入2500mL水。

②把取样管插入发酵罐内，固定。连同其他接触过微生物的容器和物品，置高压蒸汽灭菌锅中灭菌。

③灭菌后清洗干净，按要求存放。

（六）实验结果与分析

1.画出培养液中菌体生物量（g/L）随流加培养时间变化的曲线。

2.菌丝体平菇多糖的含量的测定。

附：发酵罐操作流程

1.发酵准备工作与设备检查

检查罐体安装是否正确，罐盖各配件装置就位是否正确，密封是否良好，接口有否松动等，发酵前需做保压试验。

管阀系统需检查阀门开闭状态是否正确，避免接口有松动、泄露现象。

电气控制系统需检查各电极、传感器的连接是否正确，在进入运行前需先调好各测量参数、数据显示等才能打开电源开关。

观察空压机的工作压力、压力继电器、调压过滤器是否正常，蒸汽发生的水、电、安全阀、进出器阀以及接口是否正常。

2.灭菌

准备工作：将排水硅胶软管装在排水排气口上，打开排水排气阀，关闭溢水阀和罐体上其他阀门，取出pH、DO电极校验，拔下泡沫电极、搅拌轴、顶盖接地线的连接插头，取出测温电极等，拧下冷凝器进出口接头，补料瓶上安装呼吸过滤器，拧下回水管堵头，打开蒸汽发生器提供蒸汽。

（1）空罐灭菌

装上pH、DO电极孔、三针补料口的堵头。

安装密封固定架，将进气口、取样口、补料口胶管用专用夹夹紧，尾气过滤瓶装上，并敞开尾气口。

打开控制面板，选择灭菌辅助程序，设置参数。

提供蒸汽源，打开进蒸汽阀，打开排水排气阀，使升温灭菌。

灭菌时间到，关闭进蒸汽阀和蒸汽源。可适当开大排水排气阀。等罐压降至常压，全开排水排气阀，放尽冷凝水，取下灭菌罩，灭菌完毕。

（2）实罐灭菌

空罐灭菌后，应尽快进行实罐灭菌。

装上校正好的pH、DO电极并旋上保护盖，按工艺要求放入培养液。其他操作同上述“空罐灭菌”。

3.开机和培养

（1）开机运行准备工作

安装回水管堵头，关闭排水排气阀，打开溢流水阀和冷却水源。打开空压机，将压力调整为0.1～0.15MPa。进气过滤器与压力表连接。打开气路调节阀，松开进气、尾气口胶管夹头，调节气量至所需流量。安装好搅拌电机和顶盖接地线。插上测温电极，取下pH、DO电极保护盖，并连接。将补料瓶的输液胶管安装在对应蠕动泵上，松开补料口夹头。在非运行状态下，打开总电源开关，设置较低的温度，进入RUN，使罐温迅速下降。

（2）控制参数设置与运行

按工艺要求设置搅拌转速、培养温度、pH、DO参数、消泡加液量以及相应的报警上、下参数。在1h内先进行低速运转（100转以下），等顶盖温度降至常温时再设置到要求的速度。投入运行，观察各控制参数显示情况是否正常。按工艺要求调整罐压与空气流量。

（3）接种培养

当各测量参数显示正常稳定时，就可进行接种（接种时应确保实验室空气相对静止，如关掉电扇等）。

点燃酒精盘内无水酒精或酒精棉，适当加大通气量或减小尾气流量，接种合格的摇床菌种。接种完毕按工艺要求恢复罐压和通气量。

（4）取样与放料

夹紧尾气胶管（使罐内适当增压，但罐压不得大于0.1MPa）。

把无菌取样瓶置于酒精焰上，拔去瓶塞，对准取料口，调节点压板，从取料胶管取出所需样品后再夹紧点夹子，盖上取样瓶盖，夹紧取样管口的胶管。

放去胶管内的残料。

取样前后应用75%酒精对取料口消毒。

放料方法与取料方法同。

4.发酵罐的清洁保养方法

（1）清洗

清洗前应取出pH、DO电极，按要求进行保养。

清洗罐内可配合进水进气、电机搅拌、加温一起进行，如多次换水还不能清洗洁净，则要打开顶盖用软毛刷刷洗罐内部件。方法如下：

关闭控制开关与电源开关，取下顶盖电极、电机及其连线插头，拧下进气胶管、冷凝器接头。

拧松罐盖紧固螺丝，小心、垂直向上取出罐盖，横置于平整桌面，垫好，不要碰撞，刷洗干净罐内部件。

玻璃罐取出，小心清洗干净，轻轻放回原位，注意四周间隙对称。

清洗后安装要注意罐内密封圈、硅胶垫就位情况。

拧紧罐盖四个紧固螺丝，用力均匀平衡，并注意罐与罐座间隙均衡，螺丝不要拧得过紧以免损坏玻璃罐。

（2）试车

将电极、电机、电缆、进气胶管安装就位。

安装完毕后要对罐体内通气作密封性试验。

对系统进行2～3h试运行，一切情况正常方可使用。

（3）发酵罐待用

如果短期内需再次培养发酵，应对其进行灭菌后通入无菌空气，保压待用。

如准备长期停用，需放去水箱与罐内存水，放松罐盖紧固螺丝，取出电极保养储存好，关闭电源及所有阀门，盖上防尘罩。

每次培养后应用干净抹布清除罐体上的脏物、水渍。

5.检查维护

为了保证设备的正常运行，除了熟悉设备的工作原理与各部件的结构、功能作用外，还应该加强设备的维护与管理，只有做到精心维护才能保证设备处于最好状态，延长设备的使用年限。

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（编者：高永生）