高产谷胱甘肽酵母菌种的筛选

实验十八　高产谷胱甘肽酵母菌种的筛选

一、实验目的

（1）掌握高产谷胱甘肽酵母菌的一般筛选方法。

（2）掌握酵母菌种谷胱甘肽的测定方法及其实用性。

二、实验原理

谷胱甘肽（GSH），即L－γ－谷氨酰－L－半胱氨酰－甘氨酸，是生物体内一种重要的活性三肽，由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸通过肽键缩合而成，是细胞内存在的最丰富的小分子硫醇类化合物。自1921年Hopkins首先发现谷胱甘肽的存在以来，GSH不仅作为试剂广泛应用于医学、生物学、化学和生物化学的研究测定中，而且成为一种重要的生物化学药物。谷胱甘肽作为机体内重要的生物活性巯基物质，对维持生物体内合适的氧化还原环境起着重要的作用。在人体中具有解毒、抗氧化和防衰老的生理功能，直接或间接地参与蛋白质和DNA的合成、物质的运输和细胞的保护作用，应用前景广阔。

人体所需的GSH可部分从各种食物中摄取，但因饮食结构、年龄和适应力的不同，体内GSH的供应会不足。为了维持体内GSH的平衡，适当补充GSH对健康是十分必要的。

谷胱甘肽广泛存在于动物、植物及微生物体内，其中以酵母、谷物种子、胚芽、人体和动物的心脏、肝脏、肾脏、红细胞及眼睛晶状体中含量最高。GSH在酿酒酵母中含量极高，达（100～1 000）mg／100g，可以直接食用食品中的营养酵母以获取GSH，因此工业上筛选GSH产量高的菌株一般来源于酿酒酵母。

谷胱甘肽（GSH）的测定方法有高效液相色谱法、5，5－二巯基－2－硝基苯甲酸法（DTNB）、一溴代胺荧光标记法、四氧嘧啶法、亚硝基铁氰化钠以及碘量法等。这些方法有的利用GSH的巯基反应，有的利用GSH的还原反应，各有优缺点。

三、材料和方法

（一）样品采集和菌种来源

市售的面包酵母菌粉，或者淀粉和糖类的食物如面包、馒头等在温度高于20℃条件下经几天放置已经发酵的样品。

（二）培养基

（1）YEPD培养基（斜面培养及平面纯化用）：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母膏10g，琼脂糖20g，水1 000mL，pH 6．0。

（2）种子培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母膏10g，水1 000mL，pH 6．0。

（3）摇瓶培养基：酵母膏5g，葡萄糖30g，（NH4）2SO45．0g，KH2PO46．0g，K2SO43．6g，MgSO41．5g，FeSO40．008g，MnSO40．008g，水1 000mL，pH 6．0。

（三）主要仪器

紫外分光光度计、高效液相色谱仪（配紫外检测器）。

（四）主要试剂

（1）磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钠6．80g，庚烷磺酸钠2．20g，用磷酸调pH至3．0，加超纯水定容至1L。

（2）Tris－HCl缓冲液：用Tris生化试剂加超纯水配制，用盐酸调pH至8，浓度为0．25mol／L。

（3）DTNB（5，5－二巯基－2－硝基苯甲酸）溶液：用DTNB生化试剂加0．05mol／L磷酸盐缓冲液配成0．01mol／L的溶液，存于棕色瓶中，置低温暗处备用，使用时用0．25mol／L Tris－HCl缓冲液配成0．1mmol／L的DTNB溶液。

（4）磺基水杨酸溶液：取磺基水杨酸6．0g，加水定容至100mL，质量浓度为60g／L。

四、实验步骤

（一）菌种分离和纯化

将采集的样品在种子培养基中富集培养，30℃，200r／min，12h，用无菌水稀释到10－5，10－6，10－7，涂布到YEPD平板上。挑起单菌落，在YEPD培养基进行划线分离纯化，得到纯化菌株，镜检，保留酵母菌株，将生长良好的菌种接种斜面保藏。

（二）复筛和发酵

将纯化好的菌株接种到装有10mL种子培养基的150mL三角瓶中，30℃，200r／min，12h，然后取5mL接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，30℃，200r／min，12h，然后4 000rpm离心15min，保留菌体。

（三）菌体生物量测定

每个菌株吸取10mL发酵液于5 000rpm离心15min，弃上清液，洗涤菌体3次后，置于烘箱105℃烘干至恒重，称量得其生物量。

（四）发酵液中GSH的提取

（1）收集菌体：将菌株斜面在30℃培养活化，接种三角瓶中，30℃，180r／min，培养2d，取菌液5～7mL以5 000rpm离心2min，取上清液作为待测样品。

（2）冻融法提取菌体中GSH：将收集到的菌体加入超纯水3mL混匀，于－20℃冷冻过夜，第二天沸水浴10min，取出混匀，以5 000rpm离心2min，取上清液作为待测样品。

（五）GSH含量的测定

1．DTNB衍生－光度法测定GSH含量

（1）标准曲线的绘制：取还原性GSH标准品10mg定容至100mL，得到0．100 0g／L的GSH标准溶液。取0．0、0．2、0．4、0．6、0．8、1．0mL GSH标准溶液，加水至1．0mL，分别加入Tris－HCl缓冲液3mL，混匀后取1mL加到5mL DTNB溶液中，混匀反应5min，于412nm波长处测定吸光度。以对照品质量浓度（g／mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

（2）GSH含量的测定：取待测样品溶液1．0mL，按上述DTNB衍生－光度法的测定方法测定吸光度，在标准曲线上查出GSH浓度（g／mL）。

2．高效液相色谱法（HPLC）测定GSH的含量

（1）色谱条件：DiscoverC18色谱柱（150mm×4．6mm，5μm），磷酸盐缓冲溶液与甲醇以体积9∶1混合作为流动相，流量1mL／min，检测波长210nm，理论板数按还原型GSH峰值计算，应不低于2 000。

（2）标准曲线的绘制：取还原性GSH标准品15mg定容至50mL，得到0．300 0g／L的GSH标准溶液。取0．0，0．2，0．4，0．6，0．8，1．0mL标准溶液，加水至1．0mL，加入磺基水杨酸溶液0．5mL，混匀，进样20mL，记录峰面积，以GSH标准溶液质量浓度（g／mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

（3）GSH含量的测定：取待测样品溶液1．0mL，色谱条件试验方法进行测定，在标准曲线上查出GSH的浓度（g／mL）。

五、实验结果记录

（1）在YEPD培养基上纯化和保存高产GSH的菌株。

（2）通过实验数据比较DTNB衍生－光度法与HPLC法测定酵母菌体中的GSH含量的优缺点？

六、思考题

（1）试分析不同测定方法测定同一样品中的GSH含量有一定差异的原因？

（2）现代工业上生产谷胱苷肽的菌种是采用哪些方法获得的？

参考文献

［1］闫淑珍，陈双林．微生物学拓展性实验的技术与方法［M］．北京：高等教育出版社，2012．

［2］时丽萍，郭学武，张腾宇，等．高产谷胱甘肽面包酵母菌种的筛选及发酵条件的优化［J］．食品研究与开发，2008，29（2）：30—33．