变性梯度凝胶电泳解析微生物菌群结构

变性梯度凝胶电泳解析微生物菌群结构_现代微生物学实验

实验二十一　变性梯度凝胶电泳解析微生物菌群结构

一、实验目的

（1）掌握变性梯度凝胶电泳的原理及用途。

（2）学习变性梯度凝胶电泳的操作方法，并解析环境样品中的微生物菌群结构。

二、实验原理

变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）技术是用于检测DNA突变的一种电泳技术。它的分辨精度比琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳更高，可以检测到一个核苷酸水平的差异。其原理是：双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。DGGE／TGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度或是温度梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域（melting domain，MD）和解链行为（melting behavior）。一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成。当温度逐渐升高（或是变性剂浓度逐渐增加）达到其最低的解链区域温度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。当温度再升高依次达到各其他解链区域温度时，这些区域也依次发生解链。直到温度达到最高的解链区域温度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA完全解链。因此，即使是大小相同，但碱基排列有差异的DNA片段，在不同浓度梯度的变性剂（尿素和甲酰胺）凝胶中电泳，根据部分解离的条件不同，其移动速度不同而得到分离。通过染色后可以在凝胶上呈现为分散的条带。因此，该技术可以分辨具有相同或相近分子量的目的片断序列差异，可以用于检测单一碱基的突变和遗传多样性以及PCR扩增DNA片段的检测，常常被用于环境样品中复杂微生物菌群的分析。

从环境样品中直接提取总DNA，经PCR扩增到含有某一高度可变区的目的DNA序列产物，通过DGGE得到图谱。因为每个条带就代表一个微生物物种，所以DGGE带谱中条带的数量，即反映该环境微生物群落中类群的数量。为了得到更详细的信息，往往采用种或类群专一性探针与得到的条带进行杂交或将条带切下，重新PCR扩增后测序，进而得到部分系统发育信息。

图21－1　PCR－DGGE工作流程

根据DGGE变性梯度的方向与电泳方向是否一致，可将其分为两种形式的DGGE。垂直DGGE的变性梯度方向垂直于电泳方向，常用的变性剂浓度梯度范围较宽，如0～100%、20%～70%，常用于优化样品的分离条件（即最佳变性梯度范围），电泳后经染色其DNA片段呈现“S”形曲线。水平DGGE的变性梯度方向平行于电泳方向，常用的变性剂浓度梯度范围较窄，可用于多个样本的同时分析，能更好地分离DNA片段。

三、实验器材

（一）样品

提取天然温泉水的宏基因组并制备16SrDNA V3区PCR扩增产物，作为本实验的基础材料。

（二）药品

乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Na2），丙烯酰胺－双丙烯酰胺（37．5∶1），Tris，过硫酸铵（APS），TEMED，冰醋酸，去离子甲酰胺，6×Loading Buffer。

（三）溶液

（1）0．5mol／L EDTA（pH 8．0）：在800mL水中加入186．1g二水乙二胺四乙酸二钠，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液pH值至8．0（约需20g NaOH颗粒），然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。

（2）50×TAE缓冲液：242g Tris，57．1mL冰醋酸，100mL 0．5mol／L EDTA （pH 8．0），定容至1L，高压蒸汽灭菌，室温保存。

（3）40%丙烯酰胺－双丙烯酰胺：40g丙烯酰胺－双丙烯酰胺（37．5∶1）用蒸馏水溶解，定容至100mL，4℃保存。

（4）丙烯酰胺变性胶制备：DGGE变性胶中的丙烯酰胺浓度为8%。变性剂浓度为0和100%的变性胶配方如下所示。

（5）变性剂溶液：DGGE的变性胶在普通的丙烯酰胺胶的基础上加入一定浓度的变性剂（甲酰胺和尿素），不同浓度变性剂溶液的配方如下所示。

（6）10%APS溶液：称取0．1g过硫酸铵，溶解于0．9mL的蒸馏水中。

（四）仪器

压力蒸汽灭菌器、pH计、移液枪、水平凝胶电泳仪、变性梯度凝胶电泳、凝胶成像系统。

四、实验步骤

（一）DGGE垂直电泳

1．丙烯酰胺变性凝胶胶溶液的配制

垂直DGGE的变性梯度方向与电泳方向垂直。这种胶适用于确定分离长度相同但序列不同的DNA片段的最佳梯度范围。垂直电泳的凝胶溶液中丙烯酰胺－双丙烯酰胺（37．5∶1）的浓度为8%，低浓度胶的变性剂浓度为20%，高浓度胶的变性剂浓度为70%。

2．垂直梯度胶7．5mm×10mm制胶板的装配

在灌胶之前，必须先将制胶板装配好，并检查其密封性。DGGE垂直胶的制胶板装配步骤如下：

（1）先将长玻璃板水平放置，再将两片塑料隔片分别放在长玻璃板的左右两侧，塑料隔片的厚度均为1．0mm，有凹槽的那面贴着长玻璃板，并且隔片上的小洞必须在玻璃外侧，使得两片隔片面对面，以确保凝胶溶液能流入“三明治”夹板。

（2）将短玻璃板叠在上面，底部和长玻璃板对齐，两片玻璃板和塑料隔片形成“三明治”夹板。

（3）将“三明治”夹板用左右两个夹具夹紧，并将左右两个注射螺帽拧紧，完全将“三明治”夹板固定住。

（4）将“三明治”夹板放在制胶架上，两边固定住，底部用海绵垫固定防漏，将夹具的螺丝柠松，在玻璃板中间插入直线隔片用来对齐两边的塑料隔板，对齐后将螺丝拧紧，并将直线隔板取出。

（5）将“三明治”夹板从制胶架上取出，在玻璃板中间的顶部插入两孔的梳子，从玻璃板底部的正中间插入中间隔片。

（6）将“三明治”夹板顶部用梳架固定住，确保密封性，然后将整个装置垂直放在制胶架上固定，注意短玻璃的一面正对着自己。

（7）装配好16mm×10mm制胶板，被中间隔片分成两块7．5mm×10mm的小制胶板。

3．垂直梯度胶的制备

在制胶板装配好后，将凝胶溶液用梯度形成器灌入制胶板，静置1h，等待凝胶凝固。步骤如下：

（1）将制胶板装置翻转90°。

（2）共有三根聚乙烯细管，其中两根较长的为15．5cm，短的那根长9cm。将短的那根与Y形管相连，两根较长的则与小套管相连，并连在10mL的注射器上。

（3）在两个注射器上分别标记“高浓度”与“低浓度”，并安装上相关的配件，调整梯度传送系统的刻度到适当的位置。

（4）反时针方向旋转凸轮到起始位置。旋松体积调整旋钮，将体积设置显示装置固定在注射器上并调整到4．5，旋紧体积调整旋钮。

（5）配制两种变性浓度的丙烯酰胺溶液各10mL，置于两个离心管中。

（6）每管加入60μL 10%APS，10μL TEMED，迅速盖上并旋紧帽后上下颠倒数次混匀。用连有聚乙烯管标有“高浓度”的注射器吸取所有高浓度的胶，对低浓度的胶同样操作。

（7）通过推动注射器推动杆小心赶走气泡并轻柔地晃动注射器，推动溶液到聚丙烯管的末端（注意不要将胶液推出管外，因为这样会造成溶液的损失，导致最后凝胶体积不够）。

（8）分别将高浓度、低浓度注射器放在梯度传送系统的正确一侧固定好（注意位置一定要放正确），再将注射器的聚丙烯管同Y形管相连。

（9）轻柔并稳定地旋转凸轮来传送溶液，此步骤最关键是要保持恒定匀速且缓慢地推动凸轮，以使溶液恒速地被灌入到三明治式的凝胶板中。

（10）让凝胶聚合大约一个小时，待凝胶凝固后，将制胶装置翻转180°，用同样的方法将另一块胶制好。

4．电泳

（1）在电泳槽中加入7L1×TAE缓冲液，并把电泳控制装置打开，预热到60℃。

（2）等两块胶都聚合完毕后拔走梳子，将胶放入电泳槽内，清洗点样孔，盖上温度控制装置使温度上升到60℃。

（3）将16SrDNA样品和6×Loading Buffer以5∶1混合，用注射针点样。

（4）按设定好的条件进行电泳，60℃，恒压80V，电泳1h。

（5）电泳完毕后用EB染色，然后用Bio－Rad Quantity One system拍照。

（二）DGGE水平电泳

1．丙烯酰胺变性凝胶胶溶液的配制

水平DGGE可以用来分析大量的样品。水平电泳的凝胶溶液中丙烯酰胺－双丙烯酰胺（37．5∶1）的浓度为8%，低浓度胶的变性剂浓度为35%，高浓度胶的变性剂浓度为55%。

2．水平梯度胶16mm×16mm制胶板的装配

（1）先将长玻璃板水平放置，再将两片塑料隔片分别放在长玻璃板的左右两侧，塑料隔片的厚度均为1．0mm。

（2）将短玻璃板叠在上面，底部和长玻璃板对齐，两片玻璃板和塑料隔片形成“三明治”夹板。

（3）将“三明治”夹板用左右两个夹具夹紧，将“三明治”夹板放在制胶架上，两边固定住，底部用海绵垫固定防漏。

（4）将夹具的螺丝柠松，在玻璃板中间插入直线隔片用来对齐两边的塑料隔板，对齐后将螺丝拧紧，并将直线隔板取出。

3．水平梯度胶的制备

（1）将海绵垫固定在制胶架上，把类似“三明治”结构的制胶板系统垂直放在海绵上方，用分布在制胶架两侧的偏心轮固定好制胶板系统，注意一定是短玻璃的一面正对着自己。

（2）共有三根聚乙烯细管，其中两根较长的为15．5cm，短的那根长9cm。将短的那根与Y形管相连，两根长的则与小套管相连，并连在30mL的注射器上。

（3）在两个注射器上分别标记“高浓度”与“低浓度”，并安装上相关的配件，调整梯度传送系统的刻度到适当的位置。

（4）反时针方向旋转凸轮到起始位置。为设置理想的传送体积，旋松体积调整旋钮，将体积设置显示装置固定在注射器上并调整到14．5，旋紧体积调整旋钮。

（5）配制两种变性浓度的丙烯酰胺溶液各20mL，置于两个离心管中。

（6）每管加入120μL 10%APS，20μL TEMED，迅速盖上并旋紧帽后上下颠倒数次混匀。用连有聚乙烯管标有“高浓度”的注射器吸取所有高浓度的胶，对低浓度的胶同样操作。

（7）通过推动注射器推动杆小心赶走气泡并轻柔地晃动注射器，推动溶液到聚丙烯管的末端。

（8）分别将高浓度、低浓度注射器放在梯度传送系统的正确一侧固定好，再将注射器的聚丙烯管同Y形管相连。

（9）轻柔并稳定地旋转凸轮来传送溶液，此步骤最关键是要保持恒定匀速且缓慢地推动凸轮，以使溶液恒速地被灌入到“三明治”式的凝胶板中。

（10）小心插入梳子，让凝胶聚合大约一个小时。在电泳槽中加入7L1×TAE缓冲液，并把电泳控制装置打开，预热至60℃。

（11）聚合完毕后拔走梳子，将胶放入到电泳槽内，清洗点样孔。

（12）将16SrDNA样品和5×Loading Buffer以5∶1混合，用注射针点样，上样量为30μL PCR产物。

（13）盖上温度控制装置使温度上升至60℃，然后开始电泳。

（14）电泳完毕后用EB染色，然后用Bio－Rad Quantity One System拍照。

4．电泳条件

水平DGGE的电泳条件为60℃，恒压150V，电泳4．5h。

（三）特征条带的回收及纯化

纯化的PCR产物进行DGGE分析后，然后根据需要对图谱中的条带进行割胶回收。

（1）用干净的无菌手术刀片将特征条带切割下来，用无菌蒸馏水清洗胶表面后放入洁净的无菌1．5mL离心管中。

（2）用无菌枪头将凝胶块捣碎。

（3）加入20μL ddH2O，混匀，4℃下放置过夜。

（4）稍微离心，将上清液转移到新的1．5mL离心管中。

将回收到的DNA片段再进行PCR扩增，PCR反应体系和程序同上。将回收DNA的PCR产物再用DGGE分析，确定此条带在DGGE图谱上的位置和原始条带一致，才能进行序列分析。

（四）16SrDNA序列分析

回收到的DNA片段经过PCR扩增，16SrDNA扩增引物F341－GC／R518，模板为回收产物10μL，程序采用降落PCR。测序由上海生工生物工程有限公司完成。登录NCBI（www．ncbi．nlm．nih．gov／blast／），将所得序列与数据库中已知序列进行比较。用Clustal X进行相似性分析，然后用MEGA 4．0软件构建系统发生树。

图21－2　系统发生树

五、实验记录

（1）分析电泳后形成的条带。

（2）将实验拍照结果贴到指定框内。

六、思考题

（1）DGGE技术可以应用到哪些领域？

（2）DGGE在制胶过程中有哪些注意事项？

（3）V3区为何可被用于细菌的分类学研究？

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