核酸的性质及研究技术

核酸的性质及研究技术_解读生命化学

第二节　核酸的性质及研究技术

核酸的性质是由其组成成分和结构决定的，核酸的研究和分离制备则应根据核酸的性质和结构特点等进行。核酸的主要组分是碱基、戊糖和磷酸。核酸的结构特点是相对分子质量大，分子中具有共轭双键、氢键、糖苷键和3＇，5＇-磷酸二酷键，还有许多活性基团，如羟基、磷酸基、氨基等，这些组分及结构特点，决定了核酸的性质，并作为设计研究核酸技术的依据。

核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基），也含有碱性基团（氨基），因而核酸也具有两性性质，可以利用电泳进行分离和研究其特性。由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱基是弱碱，所以核酸表现为酸性，其等电点比较低，如DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5。

一、核酸的溶解性

RNA和DNA及其组成成分核苷酸、核苷、碱基的纯品都是白色粉末或结晶，而大分子DNA则为疏松的石棉一样的纤维状结晶。

1.溶解性　碱基、核苷酸和核酸具有不同的溶解性

DNA和RNA都是极性化合物，一般都微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿、三氯乙酸等有机溶剂。所以在分离核酸时，采用加入2倍体积的乙醇使核酸沉淀的方法对其进行纯化。核酸、核苷酸、碱基在水中的溶解度依次减小，但核酸的钠盐比自由酸易溶于水；不同核酸在水中溶解所需盐浓度不同。

大多数DNA为线形分子，分子极不对称，其长度可以达到几厘米，而分子的直径只有2nm。DNA溶液的黏度极高，RNA溶液的黏度要小得多。

2.0.14摩尔法——DNA蛋白和RNA蛋白的分离方法不同

在生物体细胞内，大多数核酸（DNA和RNA）都与蛋白质结合成核蛋白形式存在，即DNA蛋白（DNP）和RNA蛋白（RNP）。两种核酸蛋白在水中的溶解度受盐浓度的影响不相同。DNA蛋白的溶解度在低浓度盐溶液中随盐浓度的增加而增加，在1mol/L NaCl溶液中的溶解度要比纯水中高2倍，可是在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低（几乎不溶）。RNA蛋白在溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L NaCl溶液中溶解度却较大。因此，在核酸分离提取时，常用0.14mol/L NaCl溶液条件来分别提取DNA蛋白和RNA蛋白，然后用蛋白质变性剂（如十二烷基硫酸钠）去除蛋白，即得纯的DNA或RNA。此法称为0.14摩尔法。

二、核酸的解离

核酸可被酸、碱或酶水解成为各种组分，通常使用色谱、电泳方法分离，其水解程度随水解条件而异。RNA能在室温下被稀碱水解成核苷酸，而DNA对碱稳定，常利用此性质测定RNA的碱基组成或除去溶液中的RNA杂质。

三、核酸的紫外吸收

核酸中的嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系存在，碱基、核苷、核苷酸、核酸都在240～290nm范围内有强烈的紫外吸收特征。由于各组分结构上的差异，其紫外吸收也有区别。例如，最大吸收波长AMP为257nm、GMP为256nm、CMP为280nm、UMP为262nm。通常在对核酸及核苷酸测定时，选用260nm波长。由于蛋白质在这一光区仅有微弱的吸收，因此可以利用核酸的这一光学特性来定位它在细胞和组织中的分布，细胞的紫外线照相主要是利用核酸强烈吸收紫外线的特性。

利用紫外吸收作核苷酸的定性测定时，通常以下列几个数据判断：最大吸收波长（λ_max）、最小吸收波长（λ_min）、在两个波长下吸收比值：250nm/260nm、280nm/260nrn和290nm/260nm。

作定量测定时，可用下式求出核苷酸含量：

核苷酸含量（%）＝M_r×A₂₆₀×100%/ε₂₆₀×c

式中，M_r为核苷酸相对分子质量；ε₂₆₀为在260nm的消光系数；c为样品质量浓度，mg/mL；A₂₆₀为样品在260nm波长下的吸收值。

对于大分子核酸的测定，常用比消光系数法或摩尔磷原子消光系数法。比消光系数ε是指一定质量浓度（mg/mL或μg/mL）的核酸溶液在260nm的吸收值，是非常有用的数据，如天然状态的DNA的比消光系数为0.020，是指浓度为1μg/mL的天然DNA水溶液在260nm的吸收值。也就是说，当测得A₂₆₀＝1时，就相当于样品中含DNA 50μg/mL。RNA的比消光系数为0.025。

摩尔磷原子消光系数ε（P）是指含磷为1mol/L浓度时的核酸水溶液在260nm处的吸收值。在pH＝7.0条件下，天然DNA的ε（P）值为6000～8000，RNA为7000～10000。当核酸变性或降解时，ε（P）值大大升高。因为大分子核酸的相对分子质量难以确定，所以用摩尔磷原子消光法测定大分子核酸更为方便。

四、核酸的变性与复性

1.核酸的变性

（1）变性的概念　核酸变性指双螺旋区氢键断裂，空间结构破坏，形成单链无规则线团状态的过程。变性只涉及次级键的变化，磷酸二酯键的断裂称为核酸降解。变性后的核酸，其理化性质和生物功能都会起急剧变化，最重要的表现为黏度降低，沉降速度增高，紫外线吸收急剧增高。RNA本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有DNA明显。

（2）变性因素　引起变性的外部因素有加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、甲酰胺等，它们都能破坏氢键、盐键、疏水键、碱基堆积力等次级键，从而破坏双螺旋区。

DNA变性的特点是爆发式的，类似于结晶的溶解，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。引起DNA发生“熔解”的温度变化范围不过几度，这个温度范围的中点称为解链温度，用T_m表示，DNA的T_m值一般在70℃～85℃之间。

（3）影响T_m的因素

①G-C对含量　G-C对含3个氢键，A-T对含2个氢键，故G-C对相对含量愈高，T_m值也愈高。

经验公式为：

（G＋C）%＝（T_m-69.3）×2.44

③溶液的离子强度　离子强度较低的介质中，Tm较低。在纯水中，DNA在室温下即可变性。分子生物学研究工作中需核酸变性时，常采用较低的离子强度。

③溶液的pH值　高pH值下，碱基广泛去质子而丧失形成氢键的能力；pH＞11.3时，DNA完全变性；pH＜5.0时，DNA易脱嘌呤。对单链DNA进行电泳时，常在凝胶中加入NaOH以维持变性状态。

④变性剂　甲酰胺、尿素、甲醛等可破坏氢键，妨碍碱基堆积，使T_m下降。对单链DNA进行电泳时，常使用上述变性剂。

2.核酸的复性

（1）复性的概念　DNA的变性是可逆的，解除变性条件后，变性核酸的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程称复性。对已经热变性的DNA溶液缓慢冷却，双螺旋DNA又重新形成，故复性又称退火。

复性时单链随机碰撞，不能形成碱基配对或只形成局部碱基配对时，在较高的温度下两链重又分离，经多次试探性碰撞才能形成正确的互补区。所以，核酸复性时，温度不宜过低，（T_m-25）℃是较合适的复性温度。

（2）影响复性速度的因素

①单链片段浓度越高，随机碰撞的频率越高，复性速度越快。

②较大的单链片段扩散困难，链间错配频率高，复性较慢。

③片段内的重复序列多，则容易形成互补区，因而复性较快。

维持溶液一定的离子强度，消除磷酸基负电荷造成的斥力，可加快复性速度。

五、核酸的含量与纯度测定

核酸含量的测定方法有紫外吸收法、定磷法、定糖法、凝胶电泳法。紫外吸收法方便，样品便于回收，是常用的方法，但灵敏度不高。凝胶电泳法配合分析扫描仪能够精确测出核酸含量。定糖法和定磷法则是通过化学方法测定核糖或磷酸，从而测定核酸的含量。

1.定磷、定糖——测定核酸含量

（1）定磷法　由于核酸中都含有磷酸基，且纯的核酸含磷元素的量为9.5%左右，故可通过测定磷的量来测定核酸含量。其原理是：先将核酸样品用强酸（如浓硫酸、过氯酸等）消化成无机磷酸；然后，磷酸与定磷试剂中的钼酸铵反应生成磷钼酸铵，它在还原剂作用下被还原成蓝色的钼蓝复合物；最后在650～660nm下比色测定，得出总含磷量（核酸磷加上无机磷），再减去无机磷（即不经消化直接测定）的量即为核酸磷的真实含量，此值乘以系数10.5（即100/9.5）即为核酸含量。

定磷法的适用范围为10～100μg核酸。

（2）定糖法　核酸分子含有核糖或脱氧核糖，这两种糖具有特殊的呈色反应，据此可进行核酸的定量测定。

①RNA　在浓盐酸或浓硫酸作用下，受热发生降解，生成的核糖进而脱水转化成糠醛，糠醛与3，5二羟甲苯（苔黑酚）反应生成绿色物质，最后在670～680nm下比色测定。有关反应为：

②DNA　DNA受热酸解释放出脱氧核糖，后者在浓硫酸或冰醋酸存在下，可与二苯胺反应生成蓝色物质，在1595～620nrn波长下进行比色测定。化学反应式为：

③定糖法的测定范围　苔黑酚法为20～25μg RNA，二苯胺法为40～400μgDNA。在此范围内光吸收与核酸浓度成正比。

2.凝胶电泳——DNA纯度鉴定

核酸纯度测定可用紫外吸收法和凝胶电泳法。

（1）紫外吸收法测核酸纯度　通常利用测定260nm与280mn光吸收比值来确定。纯DNA的A₂₆₀/A₂₈₀为1.8，纯RNA的A₂₆₀/A₂₈₀为2.0。因此，在纯化DNA时，通常用A₂₆₀/₂₈₀＝1.8～2.0作为纯度标准，若大于此值，表示有RNA污染；若小于此值，则有蛋白质或酚等的污染。

（2）凝胶电泳法鉴定DNA纯度　凝胶电泳能够按相对分子质量的大小来分离各组分，这不仅用于蛋白质的分离、制备和鉴定，也广泛用于核酸的鉴定、分离及制备。在核酸研究中用得较多的是琼脂糖凝胶电泳，它是目前分离纯化和鉴定核酸（特别是DNA）的标准方法。琼脂糖凝胶电泳操作简单迅速，用低浓度的溴化乙锭（EB）染色，就可直接在紫外灯下观察、鉴定和分析DNA，并进而制备、测定DNA。

DNA在琼脂糖凝胶中的泳动率（迁移率）取决于下面几个因素：DNA的分子大小、琼脂糖的浓度、DNA的构象、电流强度等。在凝胶电泳中，DNA相对分子质量的对数与它的泳动率成反比。因此，如果DNA样品不纯，或含有RNA，或含有小相对分子质量DNA，则在电泳过程中可明显区别开来，呈现出非单一的谱带；如果DNA样品很纯，电泳后只呈现出一条区带。

六、核酸分子的杂交技术

不同来源的DNA分子放在一起加热变性，然后慢慢冷却，让其复性。若这些异源DNA之间有互补的序列或部分互补的序列，则复性时会形成“杂交分子”。在退火条件下，不同来源的DNA互补区形成双链，或DNA单链和RNA链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程称分子杂交。核酸的杂交在分子生物学和分子遗传学的研究中应用极为广泛。如将已知基因的DNA制成具有同位素标记的DNA片段——DNA探针（DNA probe），用其去检测未知DNA分子。

杂交技术较广泛的应用是将样品DNA切割成大小不等的片段，经凝胶电泳分离后用杂交技术寻找与探针互补的DNA片段。由于凝胶机械强度差，Southern提出一种方法，将电泳分离后的DNA片段从凝胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再进行杂交，称Southern印记法或Southern杂交技术。随后，Alwlnel等提出将电泳分离后的变性RNA吸附、印迹到纤维膜上再进行分子杂交的技术，被称为Northern印迹法或Northern杂交。Southern杂交和Nonhem杂交广泛用于研究基因变异，基因重排，DNA多态性分析和疾病诊断。