五、实验内容和步骤
1．简单染色步骤
（1）涂片。取干净的载玻片于实验台上，在正面边角作个记号并滴1滴无菌蒸馏水于载玻片的中央，无菌操作方式下取菌种进行涂片，具体操作过程见图2－1。将接种环在火焰上灭菌（图2－1中1即灭菌），待冷却后从斜面挑取少量菌种与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大（注：活性污泥染色是用滴管取1滴活性污泥于载玻片上铺成一薄层即可）。
图2－1 无菌操作及做涂片的过程
1．接种工具灭菌；2．火焰上方拔塞；3．火焰封口；4．火焰附近取菌种；5．火焰封口；6．塞上橡胶塞；7．涂片；8．接种工具灭菌；9．火焰灭菌
（2）干燥。最好在空气中自然晾干，为了加速干燥，可在微小火焰上方烘干。但不宜在高温下长时间烤干，否则急速失水会使菌体变形。
（3）固定。将已干燥的涂片正面上在微小的火焰上通过2～3次，由于加热使蛋白质凝固而固着在载玻片上。
（4）染色。在载玻片上滴加染色液（石碳酸复红、草酸铵结晶紫或美蓝任选一种），使染液铺盖涂有细菌的部位作用约1分钟。
（5）水洗。倾去染液，斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至水呈无色为止。注意冲洗水流不宜过急、过大，水由玻片上端流下，避免直接冲在涂片处。
（6）干燥。将载玻片倾斜，用吸水纸吸去涂片边缘的水珠（注意勿将细菌擦掉）。或将玻片晾干或用吹风机吹干，待完全干燥后可置油镜下观察。
（7）镜检。用显微镜观察，并用铅笔绘出细菌形态图。
2．革兰氏染色步骤
细菌的革兰氏染色步骤见图2－2。
图2－2 革兰氏染色步骤
1．初染；2．水洗；3．媒染；4．水洗；5．乙醇洗涤后水洗；6．复染、水洗；7．吸水纸吸水
（1）取大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌（均以无菌操作）分别做涂片、干燥、固定。方法均与简单染色方法相同。
（2）用草酸铵结晶紫染液染1分钟，水洗。
（3）加革兰氏碘液媒染1分钟，水洗。
（4）斜置载玻片于一烧杯之上，滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色即可，随即水洗（注：为了节约乙醇，可将乙醇滴在涂片上静置30～45秒，水洗）。
（5）用蕃红染液复染1分钟，水洗。
（6）用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。绘出细菌的形态图并说明革兰氏染色的结果。
染色关键：必须严格掌握乙醇的脱色程度，如果脱色过度，阳性菌会被误染为阴性菌；脱色不够时，阴性菌会被误染为阳性菌。
思考题
1．微生物的染色原理是什么？有哪些染色方法？
2．你用革兰氏染色法进行实验的结果是什么（包括颜色、细菌形态、为何种染色反应等）？
3．革兰氏染色法中若只做1～4步而不用蕃红染液复染，能否分辨出革兰氏染色结果？为什么？
4．微生物经固定后是死的还是活的？
5．通过革兰氏染色，你认为它在微生物中有何重要意义？
6．试述细菌制片染色的主要步骤及各步骤操作应注意事项。
7．当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确、结果可靠？
8．制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？
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