有机废弃物的乙醇发酵

三、有机废弃物的乙醇发酵

乙醇发酵具有悠久的历史，是人类早期利用微生物进行酿造的成功范例之一。由于乙醇产能效率高，燃烧造成的污染小，而且能够利用再生资源大量生产，因而被认为是未来的石油替代物。

乙醇发酵所需的原料依所选用菌株而定。酵母菌是常见的乙醇发酵微生物，由于含有丰富的蔗糖酶和酒化酶，酵母菌能将蔗糖和一些己糖(葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖)直接转化成乙醇和CO₂。若选用淀粉为发酵原料，则须先用淀粉酶将其糖化，再接种酵母菌进行乙醇发酵。然而，由于世界人口的增加和可利用土地资源的日益减少，利用粮食生产乙醇的发展空间有限。因此，开发乙醇发酵新技术，利用有机废弃物为原料生产乙醇，才是解决未来能源短缺的一条根本途径。

1.淀粉和其他含糖废液的乙醇发酵

制糖工业、食品加工业产生的各种废液、废渣中通常都含有淀粉。这些废弃物可用于饲料、酵母和果糖生产外，还可以作为工业上大规模生产乙醇的重要原料。

(1)淀粉的水解

淀粉在转化为乙醇之前，须水解成低分子质量的糖类(图14-3)。淀粉的水解通常采用酶法，α-淀粉酶和葡萄糖糖化酶是催化淀粉水解的主要酶类。

在工业生产中，淀粉的水解通常采用胶化、液化和糖化的工艺流程。

①胶化反应。通过高压蒸煮使天然淀粉变性，使其更易于被进一步水解，该过程将淀粉转化为胶状物，故称为胶化过程。

②液化反应⑨在胶状淀粉中加入α-淀粉酶，随机催化其中α-1，4糖苷键水解，形成一系列低分子质量的糖，从而导致胶状淀粉的液化。高温有利于该反应的进行，选用的α-淀粉酶应具有很高的热稳定性。已经从地衣杆菌菌株中得到一种特别耐热的α-淀粉酶，能在110℃条件催化淀粉液化。

③糖化反应。在液化产物中加入葡萄糖糖化酶，使其完全水解成葡萄糖。淀粉葡萄糖苷酶是常用的糖化酶，α-淀粉酶也能直接将淀粉水解成葡萄糖。

(2)乙醇发酵

乙醇发酵通常是指酵母菌将葡萄糖转化成乙醇的过程，广义上也包括其他微生物利用糖产生乙醇的过程。酵母菌乙醇发酵的机制已经被阐明。当葡萄糖被摄入细胞内后，酵母菌利用EMP途径将其分解成丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸脱羧酶催化下生成乙醛，乙醛在乙醇脱氢酶催化下被NADH还原成乙醇。环境条件对酵母菌的乙醇发酵有很大影响，厌氧和微酸性pH值有利于乙醇的形成。

除酵母外，细菌也能进行乙醇发酵。具有工业应用潜力的菌株包括运动发酵单胞菌(Zumomonas mobile)、热纤梭菌(Clostridum thermocellum)、热硫化氢梭菌(Clostridium thermohydrosulopaircum)等。在这些细菌细胞中，由于丙酮酸脱羧酶的活性很低，丙酮酸先转变成乙酰CoA，随后在乙醛脱氢酶催化下转变成乙醛，再经乙醇脱氢酶作用生成乙醇。

(3)淀粉酶基因的改造与重组

以废弃物中的淀粉为原料生产乙醇时，其成本主要取决于所选用的淀粉酶。通过对淀粉酶的基因改造和重组，可以达到降低生产成本的目的，其具体途径如下:

①选育能利用廉价培养基的淀粉酶生产菌株，降低酶的生产成本。

②利用突变菌株或嗜热菌株生产热稳定性淀粉酶，提高淀粉的液化温度，从而提高胶化淀粉的水解速率和降低能耗。

③对α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶基因进行定点突变，使二者的最适反应温度和最适反应pH值趋于一致，进而使淀粉的液化和糖化能在同一条件下进行，减少生产工序。

④筛选或利用DNA重组技术获得能分解粗淀粉的酶，节省淀粉胶化所需的能量。

⑤构建具有淀粉水解和乙醇发酵潜能的工程菌，这样在发酵过程中可不再添加淀粉酶。

目前，在构建乙醇发酵工程菌方面已取得重大进展。研究人员已经成功地将曲霉Aspergillus awamori的葡萄糖淀粉酶基因整合到一株酿酒酵母染色体的特定位置，并能有效表达和分泌。该工程菌株能够利用可溶性淀粉，其利用率达93%，乙醇产量为118.2g/L。

2.木质纤维素的乙醇发酵

木质纤维素是植物光合作用的主要产物，是一种具有巨大开发潜力的生物能源。利用大量的农作物残余物和木材残留物进行发酵生产乙醇，已经受到越来越广泛的关注。

(1)木质纤维素的化学组成

木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。这几种组分以不同的比例形成木质纤维结构(表14-4)，从而构成了植物的支持系统。

①纤维素。纤维素是生物圈中最丰富的多糖，是构成植物细胞壁的主要成分，通常可占植物干重的20%～40%。纤维素是由葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接而成的直链分子，一条链可由一万多个葡萄糖残基构成。

纤维素作为植物支持结构的主要构成部分，其长链分子排列紧密有序，并在部分区段形成结晶体，因此，天然纤维素不溶于水，难以水解。

②半纤维素。半纤维素是由戊糖和己糖组成的异源多糖，根据其主链组成不同可分为三类。第一类为木聚糖，其主链由聚β-1，4-木糖构成，支链则由阿拉伯糖、葡萄糖酸、阿拉伯糖酸组成;第二类为甘露聚糖，包括葡萄糖甘露聚糖和半乳甘露聚糖。第三类为阿拉伯半乳聚糖。

半纤维素的组成通常由木质纤维材料的来源所决定，例如，木聚糖在硬木中有很高的含量，而葡萄糖甘露聚糖则广泛存在于软木中。与纤维素相比，半纤维素的相对分子质量较小，并且均为无定形结构。

③木质素。木质素是由苯丙烷亚基组成的不规则多聚体，其分子质量大于1.0×10⁵U，不溶于水，难以水解。

木质素中的苯丙烷单元中的芳香环之间由很多不同的化学键连接在一起。木质素的理化性质在很大程度上是由木质素合成过程中的最后一步决定的，这是一步非酶促的自由基加合反应，该步反应具有很大的随机性，因而导致木质素分子的不规则性。在天然状态下，木质素通过化学键与半纤维素连接，然后包裹在纤维之外，形成纤维束。正是由于木质素的存在使得植物具有一定的硬度，能够抵抗机械压力和微生物侵染。

表14-4　　几种木质纤维材料的组成

(2)纤维素的乙醇发酵

天然木质纤维难以被微生物有效降解，为提高乙醇发酵过程中纤维素的利用率，通常要对木质纤维原料进行预处理。木质纤维原料的预处理有物理方法和化学方法两大类。前者包括辗磨、挤压、热解、曝气等方法，后者主要为酸碱处理。化学处理较物理处理有效，但成本高，且废液难处理。由加拿大等国开发的蒸汽爆破技术能大幅度提高木质纤维原料的水解率，并且能进行连续化操作，因而具有广阔的应用前景。

由于许多乙醇发酵的高产菌株都不能直接利用纤维素，因此，如何有效地将纤维素转化成这些菌株可利用的糖是问题的关键。虽然酸碱处理能将纤维素水解，但这一方法在成本、设备和环保方面存在诸多弊端。另一种可供选择的方法是酶法水解。在纤维素酶的作用下，纤维素最终被水解为葡萄糖，工业上称这一过程为纤维素的糖化。纤维素酶是一种多酶体系，包括葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶、纤维素水解酶、β-葡萄糖苷酶或纤维二糖酶。目前，利用酶水解纤维素生产乙醇，在技术上还存在以下问题:酶耗高、酶解周期过长、酶水解率低等。酶解产物的抑制作用是影响酶解反应速率的主要因素。在纤维素水解过程中，由于纤维二糖、葡萄糖等酶解产物的不断积累，就会抑制纤维素酶的活性，从而导致酶解反应速率下降。

同步糖化发酵(stimultaneous saccharification and fermentation SSF)是解决纤维素发酵生产乙醇过程中产物反馈抑制问题的一种方法。该方法是在同一反应器中同时进行糖化和发酵。在此过程中，由于酶解产物葡萄糖被酵母迅速转化为乙醇，从而有效降低了对纤维素酶的抑制作用。为进一步消除乙醇对纤维素酶和发酵菌株细胞的影响，近年来相继研究开发了一些反应与分离过程相结合的新技术，可以在发酵的同时在线去除乙醇。这些技术包括溶剂萃取、膜蒸馏、超滤结合反渗透、渗透蒸发等。

工业上利用微生物进行纤维素的乙醇发酵有三种方式:直接法、间接法和共培养发酵法。

直接法是指同一微生物完成纤维素的水解、糖化和乙醇发酵的全过程。热纤梭菌能分解纤维素，并能将纤维二糖、葡萄糖、果糖等转化成乙醇。此外，将纤维素酶基因引入酵母细胞后，构建的工程菌株也能用于纤维素的直接发酵。

间接法是指先利用一种微生物水解纤维素，收集酶解后的糖液，再利用酵母发酵生产乙醇。常先用木霉的纤维素酶来水解纤维素，然后利用糖液进行发酵。此方法能达到较高的乙醇产量，但是生产成本也较高。

共培养发酵法亦称混合发酵法，是指利用一种纤维素酶生产菌和一种乙醇发酵菌在一反应器同时进行纤维素的糖化和发酵。在这一工艺过程中，纤维素水解后产生的葡萄糖可以被不断地用于发酵，因而可以提高水解效率。

利用微生物进行纤维素的乙醇发酵有着广阔的应用前景。目前存在的主要问题是原料预处理和纤维素糖化的成本过高，而现代生物技术的发展已经为解决这一问题奠定了基础。