基因工程在原位生物修复等污染控制系统中使用的风险与防护

五、基因工程在原位生物修复等污染控制系统中使用的风险与防护

把不同生物种中的降解(基因)片段重组到受体菌株是一种提高能力的重要策略，特别是随着对功能基因组研究的不断深入，人们认识了越来越多的微生物基因组和降解操纵子，通过Shuffling基因和启动子可以构建更多的GEM，以便应用于原位生物修复等生物净化系统。应用GEM也产生相应的风险，风险主要来源于基因水平迁移和导入GEM不受控制的增殖。

GEM释放后在实现它们希望的降解任务后受到环境的限制而被消除或者避免消除和进化繁殖。后者的情况会造成GEM使用的风险。在过去的十年中科学工作者研究导入一种自毁系统(suicide system)以便杀死完成降解任务后仍然存活于环境中的GEM，以把GEM的使用风险降到最低限度。这种系统也称为“细菌围堵系统”(bacterial containment systems)。

细菌的自毁系统来源于细菌的遗传系统。许多细菌质粒、染色体和细菌噬菌体携带有杀死基因(killer genes)和杀死者-抗-杀死基因(killer-anti-killer gene)。携带杀死基因(质粒上)的细菌所表达的毒素可以杀死无质粒细胞(无质粒细胞来源于带有质粒的群体)。杀死者-抗-杀死基因的作用机理在于二种基因的表达，杀死(killer)毒素可以稳定数小时，但它的抗-杀死(anti-killing)的对应物(counterpart)是非常不稳定。解毒剂可以中和它们的同源毒素(蛋白质)或者不被合成。这些基因系统已被应用于GEM的构建，这些基因如hok、gef、sac、nuc、relf和colE3。

Molin等在1987年提出了首个围堵系统，这以后一种自毁系统的概念被研究者用于生物修复GEM的负控-安全系统(“fail-safe”system)。这种系统的模式如图15-20(a)所示。Killer基因是负调控的。当污染物存在时，污染物与调节蛋白结合并诱导产生阻抑蛋白，阻抑蛋白起阻止杀死基因(killer gene)的转录作用，从而不能产生毒素，而当污染物浓度很低时阻抑蛋白不被诱导产生，杀死基因转录产生毒素，细胞被杀死。链霉抗生物素蛋白(streptavidin)系统就是此后构建的这样一个系统。在这个系统中，编码链霉抗生物素蛋白的基因被启动子所控制，启动子(promoter)又受阻遏蛋白控制。这种阻遏蛋白是响应环境污染物存在而合成的。在缺乏污染物时，细胞产生链霉抗生物素蛋白，其能和D-生物素结合(D-生物素是某些细胞必需酶的辅基)，因此使细胞死亡。这种类型系统的主要缺点是自毁基因和控制片段会发生随机突变(random mutations)而使GEM从程序杀死中逃脱。最近人们又构建了一种双重致死系统，在这种系统中，大肠杆菌素(colicin)E3 RNase和ECORI内切核酸酶(致死基因)同时控制细胞死亡(分别控制不同的细胞靶RNA和DNA)。这种系统的发展能减少“逃避”的机会，这是因为两种酶同时突变看来不可能。

图15-20　保证向环境导入GEMs安全性的细菌围堵系统

(a)杀死基因(killer基因)受环境信号调控的模式围堵系统，存在污染物时，杀死基因受抑制;然而污染物的消耗则解除杀死基因的阻抑，细胞死亡。(b)围堵系统中杀死基因组成型表达，它的对应物抗杀死基因(anti－killer)受环境信号调控。在缺乏污染物时抗杀死基因终止表达，立刻杀死细胞。实心箭头代表启动子，黑色箭头代表正调控，蓝色箭头代表组成型调控，而黄色箭头代表负调控。

现在的围堵系统还需要进一步科学精致以减少细胞脱避程序死亡的可能性。适应这种要求而产生一种新的构建模式。在这种模式中，杀死基因(killer gene)的产物构成型(constitutively)产生，而它的相应(cognate)抗杀死基因的表达受环境信号(图15-20(b))控制。这样，存在污染物时抗杀死基因(anti-killer gene)表达，中和杀死基因(killer gene)的自毁效应;不存在污染物时，细胞将会快速被杀死，因此避免任何繁殖的机会和进入环境的GEM不受控制的生长。另外还可使用双致死系统(两套杀死者-抗杀死对，two killer-antikiller pairs)，在这种系统中，杀死基因中的一种被置于质粒，其他毒素和解毒剂基因被置于染色体，这使自毁功能受到更严格的调控，在质粒控制基因水平转录时，促进细胞直接死亡。在这种构建的类型中，存在一种以上的启动子——解毒剂融合(即启动子受不同污染物的诱导)将促进其在受异质性污染物混合物污染地点的生物修复中得到应用。