神经元细胞

神经元细胞_组织工程学实验技

一、神经细胞的获取

从组织工程学的角度而言，神经细胞（即神经元）主要获自神经干细胞及其诱导分化的终末神经细胞。神经干细胞的可能获得途径包括胚胎来源和成体来源两个途径，胚胎来源的神经干细胞是指来源于早期胚胎或胚胎神经组织的神经干细胞，成体来源则是指从成体神经组织或成体非神经组织中得到的神经干细胞。所有神经细胞都可视为神经干细胞的终末分化结果。

（一）胚胎来源的神经干细胞

胚胎来源神经干细胞可来自早期胚胎或胎儿神经组织。

1．早期胚胎来源　来自早期胚胎（桑椹胚－胚泡）的细胞具有发育全能性（totipotent），在合适的环境条件下可发育成完整的个体（包括体内三个胚层220余种类型的细胞），为全能干细胞。而来源于三胚层以后其他阶段胚体内的干细胞则丧失发育成为完整个体的能力，为多能干细胞。从早期胚胎分离得到的胚胎全能干细胞能在体外长期培养，并具有高度未分化特性，在适合的条件下可分化为胎儿或成体组织细胞，包括神经组织细胞。Thomson等在研究小鼠胚胎干细胞的基础上发现，灵长类与人类的胚胎干细胞具有相同潜能，均可分化为神经干细胞。人类胚胎干细胞（human　embryonic　stem cell，hESCs）在本质上同取自恒河猴等不同种属动物胚胎干细胞的方法一样，都取自胚胎胚泡阶段的内细胞团。此外，还有一种取自胎体中即将发育为睾丸或卵巢部位的细胞，被称为人胚胎原生殖细胞（human　embryonic　germ　cell，hEGCs）。

人类胚胎干细胞的来源一直备受社会各界的关注，实验用人胚通常取自冷冻胚胎（即不育治疗诊所多余的或废弃的胚胎）和克隆胚胎（即用人类细胞克隆的胚胎，包括治疗性克隆和生殖性克隆）。人类受精卵在发育5d后的胚胎被称为胚泡，胚泡是个针尖大小的细胞球。在第6天，胚泡内部的细胞群开始形成，细胞群中含有干细胞，这些细胞能形成人体的所有细胞，如果植入子宫中，它们将转变为胎儿，因此这种胚胎克隆也称作生殖性克隆；如若从胚泡中取出干细胞，而后放到培养液里，利用特殊技术，在培养皿中使干细胞生长成多种不同的细胞、组织甚至器官，并以所培养的细胞、组织、器官治疗各种疾病，则这种胚胎克隆称之为治疗性克隆，但由于这一过程破坏了胚胎，因此引发出了道德和伦理等方面的争议。除了可由早期胚胎培养分化出神经干细胞外，胎儿神经组织也是提取并培养分化为神经干细胞的另一来源。

2．胎儿神经组织来源　在胚胎脑发育过程中存在着神经干细胞，且越早期的胎脑中，其神经干细胞的比率也越高；至出生时则只有室周区、纹状体区、海马区等部位含有一定比例的干细胞。将取自隔区的细胞在单个培养时能形成细胞克隆团，其中有22%的细胞团在分化后即含有神经元又包含非神经元，大部分细胞团则只向神经元或胶质细胞分化，提示环境信号能影响这些组成细胞团的神经干细胞分化。有实验显示，将近20%的胚胎脑皮质神经干细胞可形成神经元和少突胶质细胞；源自胎儿神经组织的细胞单个培养后能分化成神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞，即全部神经组织细胞类型；少突胶质细胞和2型星形胶质细胞都来自于胎脑内一种称之为少突细胞2型星形细胞（Oligodendrocyte－type－2astrocyte，O－2A）的多能先祖细胞，而血小板源性生长因子（platelet－derived　growth　factor，PDGF）和睫状神经营养因子（ciliary　neurotrophic　factor，CNTF）都能影响O－2A细胞的分化；如果在培养中加入bFGF，就会加快O－2A细胞的繁殖速度而形成大量胶质细胞。来自胚胎神经系统不同部位的神经干细胞均具有向不同的神经细胞分化的潜能，这些细胞不仅能从人胎儿大脑皮质中分离出来，还可经EGF、bFGF等扩增出细胞团并诱导细胞分化出神经元及星形胶质细胞，如将这些人胚脑神经干细胞移植到幼鼠脑的生长区，移植细胞则能够良好地生存、分化及迁移，并可以表达外源基因。神经嵴细胞是胎儿神经组织源性神经干细胞的另一发源地。神经嵴细胞在体外培养能自我更新和分裂，将其实验性地移植入鸡胚即可形成神经元和神经胶质细胞，充分显示了神经干细胞的特征。

从动物获取胚泡研究胚胎干细胞相对容易，可在交配后合适的时间段内获取。但获取人类早期胚胎（胚泡）往往受到技术条件的限制（来源和数量有限）以及伦理道德的束缚，使人胚神经干细胞的研究及应用受到极大的制约。

（二）成体来源的神经干细胞

成体来源的神经干细胞是指来源于成年神经组织的神经干细胞以及由成年其他组织干细胞逆分化而来的神经干细胞。包括成体神经组织及成体非神经组织源性神经干细胞。

1．从成体神经组织中分离出神经干细胞　目前，对成体神经干细胞在中枢神经系统中的确切功能尚无统一认识。多数学者认为，它们长期调节着细胞的自我更新；也有推测，成体神经干细胞是一些需要保持器官和组织更新来适应恶劣环境的原始生物（如涡虫、鱼类等）进化后的遗迹；另一种观点则认为，成体神经干细胞对使中枢神经系统保持有限的自我更新能力以维持诸如学习、记忆等功能来说是重要的。而成体脑和脊髓又的确存在有可以分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的神经干细胞。经过多年的争论和深入的研究，现在逐渐被接受的观点是：在所有的成体哺乳动物脑内有两个高密度的细胞分化区，即脑室下区（subventricular　zone，SVZ）和海马结构齿状回的粒下区（subgranular　zone，SGZ）。近年，从成体中枢神经系统中分离出了脑室上皮细胞和脑室下区细胞两个种群的细胞，但还不清楚它们是两个独立的种群还是品系相关。也曾有人发现，在受损的生长期脑组织，不死细胞可以迁徙到损伤区替代衰竭细胞。在成体恒河猴的额叶、颞下叶、顶后叶和皮质等处也有新的神经组织发生，但在诸如髓纹皮质这样一些原始感觉区则没发现新的神经组织形成。也有人从成年人的嗅球部位分离得到了神经干细胞，表明成人的嗅球有再生的潜能，可作为神经干细胞的来源。

2．从成体非神经组织中分离出神经干细胞　除中枢神经组织存在有神经干细胞之外，骨髓、脂肪、皮肤、血液、肌肉组织、角膜、视网膜、胰腺等成熟组织也均存在有可横向分化为神经干细胞的干细胞。Singh等（2001）报道，已成功在体外将人和小鼠骨髓的间充质干细胞（mesenchymal　stem　cell，MSCs）通过加入特殊生长因子诱导分化出成熟神经细胞，提示成年MSCs具有多分化潜能，特别是有可能诱导分化成等神经组织细胞；同时也可以逆分化，即由一种类型细胞变成另一种细胞类型。目前研究显示，理想的神经细胞种子细胞应该是：①容易获得；②能够体外培养快速扩增；③无免疫排斥；④能长期存活并与宿主脑整合。鉴于自体免疫排斥的问题和伦理方面的争论，逆分化途径获取干细胞可能是未来的主要方法。

除了移植神经干细胞或胚胎组织修复神经组织损伤的两种途径外，在中枢神经功能损伤后修复再生过程中，CNS的自身修复系统亦不容忽视。多项体外培养实验显示：bFGF和EGF可促进胚胎和成年的神经干细胞分裂增殖。哺乳动物中枢神经系统的神经元再生能力有限并非由于缺乏足够的神经干细胞，而是由于很大程度上缺少刺激神经干细胞分化的必需神经营养因子的缘故。Craigig等将EGF注入老鼠的侧脑室，结果发现脑室下区Nestin阳性的细胞数明显增多。

在神经干细胞移植、胎脑组织移植以及促使CNS原位产生新的神经组织细胞这三种主要创伤CNS组织修复途径中，CNS的自身修复系统不容忽视，神经干细胞的原位诱导或移植将作为未来攻克严重中枢神经功能损害的关键生物技术平台，具有广阔的应用前景。

（三）胚胎获取及分离

由动物不同发育阶段的实验性全胚中可以获取任何组织的干细胞（包括胚胎神经干细胞）。施行全胚胎培养主要涉及胎龄计算、胚胎获取及胚胎培养几个方面。

1．胎龄计算　以小／大白鼠为例，可以选用涂片法和阴栓法的任何一种方法对胎龄进行计算。①涂片法。胎龄依照检查动物的性周期和受孕而确定。每日做雌鼠阴道脱落上皮细胞涂片，排卵期将雌雄鼠合笼并继续每日涂片，以出现精子为准计算受孕期。经涂片法对成年雌鼠不同生理周期的认证方法（图4－9，彩图11）：排卵间期可见大量白细胞与大多角有核或无核脱落上皮细胞；排卵期则涂片仅见有大多角形脱落上皮细胞，并以无核角化细胞为主。于排卵期合笼后的雌鼠涂片中，以观察到精子之日计为受孕0．5d。②阴栓法。小／大白鼠生长在人工控制的光照周期环境中，使“暗∶亮＝12h∶12h”。自早上6点到下午6点为光照期；下午6点到次日清晨6点为黑暗期。将1至几只雌鼠置入一铁丝笼内，在黑暗期开始放入一具有生育能力的雄鼠。如果动物在黑暗周期的中期（即清晨零时）交配并于交配后立即受精，则次日晨检查雌鼠就可在阴道处发现黄白色的栓子，即由精液凝聚而形成的阴栓，将发现阴栓的当日中午计为受孕后的0．5d。

图4－9　雌鼠阴道脱落细胞涂片法判定胚鼠胎龄（碱性亚甲蓝染色，×200）

a．排卵间期：白细胞（箭头）与大多角形脱落上皮细胞（空箭头）混合存在；b．排卵期：仅见有大多角形细胞，并以无核角化细胞为主（空箭头）；c．受孕0．5d：涂片中出现精子（箭头）
（参考引自姜晓丹，徐如祥，廖可立，等．中华神经医学杂志，2002；1（1）：41－44）

动物胚龄的准确计算对于胚胎神经干细胞的取材十分重要。例如，桑椹胚期或胚泡期可以取到全能的胚胎干细胞（embryonic stem　cells，ES细胞）并在此基础上进行神经干细胞的诱导分化；神经管形成期间可以获取室管膜神经干细胞；胚体形成之后至出生前则可获得胚神经组织源性神经干细胞等。如若对动物胚龄及其相应时期的发育情况不清楚，将不能保证取材的准确性和可靠性。

此外，如若对人胚标本进行研究，也须对胚龄进行估算。人胚龄的计算方法有末次月经计算法和外形特征粗略估算法两种，①末次月经估算法：妊娠时间通常从孕妇最末一次月经的第1天算起，至分娩为止共280d左右（以每月28d计算则为十月怀胎）。但排卵时间通常是在月经的第15天左右，所以真正的胚胎发育时间应从排卵受精算起，共为265d左右。因此应以末次月经算起的第15天左右计为受孕时间。②外形特征粗略估算法，可以用测定胚胎长度再经查表的方法确定胚胎年龄；也可根据胚胎外形特征粗略估算胚龄。测量胚胎长度的方法有三种：①最长值（greatest　length，GL），多用于测量第1～3周的胚。②顶臀长（crown－rump length，CRL），又称坐高，用于测量第4周及以后的胚胎。其中一种是颈臀长度测量，适用于第4周左右的胚胎，因头向腹侧屈曲、故从颈部最高点量至尾部最高点；另一种是冠臀长度，适用于第8～9周的胎儿，由头顶量至臀部。③顶跟长（crown－heal　length，CHL），又称立高，也适用于测量胎儿。测量胎儿立高的方法也有两种，一种是测量冠踵长度，即从头顶量至坐骨结节、从坐骨结节量至膝盖、再从膝盖量至脚跟，三者之和即为立高；另一种是计算略估胚胎立高（厘米）法，前5个月的胚胎是月份自乘得出立高（例如第4个月的胚胎立高为4×4＝16cm），后5个月的胎儿是月份乘5得出立高（例如第8个月的胎儿立高为8×5＝40cm）。在胚胎干细胞研究中的人胚胎龄估算，主要用于自然流产或水晶囊引产胎儿研究时参照之用。用B超测定孕妇体内胚胎的顶臀长等与直接测量胚胎标本的数据很接近。

2．胚胎获取及培养　主要是植入后小／大鼠全胚胎的获取与培养。主要技术要点包括操作缓冲液及血清培养基的制备、胚胎分离与培养、指标观察等。

（1）操作缓冲液的制备：可任选用下列缓冲液。①Dulbecco’s袋装的磷酸缓冲液粉（Dulbecco’s　phosphate　buffer　solution，DPBS）（Gibco，115－030）配置操作缓冲液，主要应用于植入后8d小鼠（或10d大鼠）胚胎的分离操作。每袋D－PBS溶于800ml双蒸水中，加入0．6g的氯化钙，在粉末充分溶解后加入4g牛血清清蛋白（bovine　serum　albumin，BSA，Sigma，A9418），置于室温直至所有的BSA溶解为止。调整pH至7．4，之后加入重蒸水至1　000ml。最后，溶液经直径为0．22μm的微孔滤过膜（milipore）过滤消毒后储存于4℃备用。②D－Hank’s缓冲液，是一种无机盐溶液和平衡盐溶液（balanced　salt　solutions，BSS），简称HBSS。配制时主要应避免钙镁离子沉淀，D－Hank’s缓冲液由原液A和原液B构成，应用时各取1份原液A、1份原液B和18份双蒸水，混合后在10磅高压蒸汽条件下灭菌15min，以无菌的5．6%NaHCO3调pH至7．2～7．6即可使用。原液A的配法：NaCl　160g，KCl　8g，CaCl22．8g，MgSO4·7H2O　2g，MgCl2· 6H2O　2g，以上溶于1　000ml蒸馏水中。原液B的配法：先将Na2HPO4·12H2O　3．04g，KH2PO41．2g，葡萄糖20．0g溶于800ml双蒸水中；再取酚红0．4g放入玻璃研钵中，滴加0．1NNaOH不断研磨直至完全溶解（约加0．1NNaOH　10ml），将溶解的酚红吸入100ml量瓶中（注意洗下研钵中残留酚红液并加入量瓶内），补加双蒸水至100ml，则配成了0．4%的酚红溶液；将已配好的800ml钠钾盐溶液和100ml浓度为10．4%的酚红溶液混合并补加双蒸水至1　000ml，则配成原液B。

（2）培养用血清的制备：培养小／大鼠全胚所用的培养基是纯鼠血清，须由小／大鼠抽取全血后立即离心制备，最好使用塑料器皿，以延缓凝血过程。以Sprague－Dawley（SD）大鼠为例。①麻醉与备皮：将鼠置于盛有乙醚的罐内使之失去知觉，仰卧位固定于实验台上；腹部剪毛备皮。②暴露背主动脉：常规碘酒消毒、75%乙醇脱碘；于腹部做“V”形切口，将腹内小肠取出置于鼠的右侧，将直肠与小肠从连接的肠系膜分离，应用两对镊子暴露背主动脉。背主动脉位于中线偏右，粉红色，可见随心跳而搏动。在背主动脉旁可见一略大、暗红色的血管为静脉，要注意区别。③抽取全血及注意事项：用大小为21G的针头插入暴露1cm的背主动脉中，插入之前需将针筒内空气抽净，针头一旦刺入主动脉就不可再拔出，以免血液喷射；此外，还必须保持大鼠具有节律性心跳和呼吸；一旦大鼠死亡，就不能用注射器再获取血液。抽血时要轻轻吸取，注意不能抽吸过猛，否则将会因红细胞溶解而降低血清质量。抽血可持续到大鼠呼吸停止为止。当实验孕鼠呼吸减弱时可挤压胸腔以利辅助呼吸，同时不断挤出心脏的残余血液，一般可挤血10～12ml。通常情况下，全血回收总量大致为：雄性大白鼠20ml，雌性大白鼠10ml，小白鼠5ml。抽完血之后，用剪刀在大鼠膈肌上剪一孔以保证其死亡。④离心获取血清及其灭活：将抽得的全血转入无菌离心管中离心（2　200r／min）至少5min；离心后可于血的上层形成一白色的纤维性凝块，以无菌巴德吸管挤压后获得血清；再于室温条件下离心（2　500～ 3　000r／min）5min，获取上清液（黄色透明状的纯化血清）并注入新离心管中；于56℃30～45min条件下灭活补体，同时打开瓶盖以利蒸发，使乙醚彻底挥发。灭活后的血清置加盖离心管中保存于－20℃条件。该血清在－20℃条件下可保存1～2周；如计划更长时间保存，可放置－70℃冰箱内。血清内可加青霉素50　000U／ml、链霉素50　000μg／ml以防感染。⑤血清使用前的处理：临用前数小时，将装有血清的试管恢复到室温或于水浴条件下孵育至37℃；加热后的血清应再离心（2　000r／min）5min以去除冷冻过程中形成的沉渣，也可以用直径为0．45μm的滤膜过滤除去渣质。超净工作台内取数毫升血清转入无菌培养瓶中（依每2ml放1个胚胎的标准取血清），于隔水式培养箱（water－jacked incubator）内以5%CO2预平衡。对培养瓶的要求是，外面光滑利于旋转，内面光滑防止损伤胚胎；理想的瓶型为短颈、深肩，这样可以在倒入培养基时避免培养基产生小气泡，胚胎可以寄宿在瓶颈部，也可有相对大量的气体进入瓶子里。

（3）全胚培养基：对于动物实验而言，胚胎可以在静态的液体培养基中培养，也可以在流动的培养基中培养。全胚胎培养装置要求置入的胚胎固定，基质可以从其循环流过。这种方法常用于持续观察胚胎发育过程。最简单、最有效的方法是应用旋转瓶进行培养，持续旋转的瓶子使培养基液体不断地进行氧合作用，有助于胚胎在培养基中的呼吸。小／大鼠胚胎的转动培养方法所用的培养基即为同系鼠的血清（制备方法同上述培养用血清的制备）。血清的制备对成功的后续培养起着关键作用。获得血液后立即离心制备的血清比延迟一段时间后再离心制备出的血清效果更好。雄性、雌性、妊娠与非妊娠动物的血清对培养结果无显著差异。某些稀释过的血清能改善12．5～13．5d的大鼠胚胎发育进程。如果将血清稀释为75%或90%等不同浓度就会发现，稀释为95%的血清在使用时加热过程中由于水分的蒸发而浓缩，其渗透压又回到了原来血清的渗透压；而稀释的血清浓度一旦小于75%，则会使胚胎生长受到抑制。目前认为接近大鼠血清效果的异种血清只有人血清。人血清内加糖3mg／ml，则有利于对胚胎培养的支持作用；但人血清也并非为大鼠血清的完全代用品，如果混用血清培养基，用以90%的人血清与10%的大鼠血清混合在一起是较满意的全胚培养基。

（4）胚胎分离：①处死孕鼠。大鼠用过量麻醉法：实验手术的麻醉剂量为每100g体重大鼠腹腔注射10%水合氯醛0．4ml，致死剂量则可参照实验剂量用药。小鼠用颈髓断离法：以一只手的拇指和示指紧抵住小鼠颈后部固定头部，另一只手将鼠尾向后拉扯致小鼠颈部与脊髓分离致死。②剖腹取胚胎：将处死的孕鼠置75%乙醇中浸泡消毒5min，乙醇消毒有助于将孕鼠腹部毛湿润，以防毛发飞扬而导致污染腹内脏器。将消毒后孕鼠仰卧位固定于实验台上，于腹部做一“V”形切口，“V”形切口的尖端朝向耻骨联合；打开腹腔，将小肠置于一侧以暴露子宫。小／大鼠子宫呈“Y”形，怀孕的双侧子宫体8串珠样（每个“小珠子”即为一个小胚胎）切断子宫的阴道端，以尖镊垂直提起，再用小剪刀沿子宫系膜方向剪开。当子宫角完全打开后，用钝剪从子宫角沿子宫壁分离蜕膜，在此过程中子宫角的阴道端始终被直立提起。需小心不要挤压蜕膜，以免蜕膜内的胚胎会被挤压变形。采用同样步骤对另一侧的子宫蜕膜进行分离。③胚胎处理：被剥离的蜕膜置于盛有预温D－PBS或D－Hank′s液的培养皿中，轻轻洗去组织碎片和血。以显微手术镊在解剖显微镜下仔细将包于蜕膜中的胚胎在温暖的培养基中由蜕膜组织分离出来。注意保留胚胎与蜕膜的黏着部分以利于血管钳夹取并避免损害胚胎的膜。孕育8．0～8．5d胚鼠的母鼠子宫蜕膜呈三角形，具有一宽的底部为胎盘极（placental　pole）和一尖顶部称胚极（embryonic　pole），剥离要由蜕膜组织的胎盘极开始，以一对镊子分别夹住胎盘极一侧的蜕腹瓣，轻轻将蜕膜撕成两瓣；去掉一半蜕膜而留下另一半包有胚胎的蜕膜，然后一片片地剥除包围胚胎的蜕膜组织，胚胎即被暴露出来；小心打开极薄并富含血管的Reichert膜，由胚极向胎盘极方向仔细剥离直至清除干净，注意不要弄破卵黄囊（vesceral　yolk sac），以免影响胚胎在体外的正常发育；将分离完毕的胚胎移入新鲜的D－PBS或DHank′s液，可应用于培养前的实验操作，如组织标记或移植切除等。

（5）全胚胎培养：将准备进行培养的胚胎转入一含有事先已用合适的混合气体预平衡的大鼠血清培养基消毒培养瓶中。每5ml大鼠血清或4ml大鼠血清＋1ml　EME（minimum　essential　medium）可培养5个鼠胚胎，鼠胚胎占据全部体积的1／10。将装有胚胎的培养瓶加入混合气体（O25%，CO2 5%，N290%），轻轻摇动5min；旋紧瓶盖，继续在手中轻轻摇动培养瓶使胚胎自由地悬于培养基中；把培养瓶置于37℃的旋转培养箱内，旋转速度为20～30r／min，每隔8～12h加一次气体，培养18～24h；以含O240%，CO25%，N255%的混合气体换气，48h后即可获得完好胚体。在培养期间，可于显微镜下观察胚胎的形态学特征。

（6）观察指标：培养中的全胚发育程度随移出母体时胚龄的增长而增长。检查时，将胚胎由含气的培养瓶中移入含有预温培养基的培养皿中，主要检查卵黄囊循环和心脏搏动并记录，然后从脏壁卵黄囊和羊膜囊中分离胚胎，在解剖显微镜下检查胚胎的形态学特征并与在宫内同步发育的胚胎特征相比较。形态学检查内容包括体节数目、鳃弓、前肢芽、眼耳原基、神经管的闭锁及胚体旋转等情况。

二、神经细胞体外培养的调控

组织工程学的神经细胞体外培养调控主要是指不同组织来源神经干细胞向神经细胞的诱导分化调控，有体内诱导分化和体外诱导分化两种情况。体内诱导分化主要通过组织细胞间相互诱导、抑制和识别等控制完成，属于体内的原位诱导。体外诱导分化则是利用神经干细胞的基因转录调控机制及细胞受不同条件作用而于相互诱导、抑制和识别等方面发生相应变化等机制，在体外对ES细胞源性或胚神经组织源性等不同来源神经干细胞诱导分化所从事的实验性和（或）应用性研究。此处主要阐述体外诱导分化实验的相关技术要点。

（一）ES细胞及胚胎组织体外定向诱导分化的调控途径

1．特殊培养基诱导法　主要是根据ES细胞的自我增殖与多分化潜能以及神经干细胞生长所需的支持环境，配制特殊的神经干细胞培养基，诱导ES细胞向神经干细胞的方向发育分化。常用的培养基是以L－15CO2培养液或者以低糖DMEM／F12为基础培养液，添加不同成分配制成。

2．基因转染定向分化调控法　对于ES细胞向神经干细胞方向分化而言，应用基因转染定向分化调控法的关键是以确定神经组织源性神经干细胞主导基因为前提，以此为标准并在此基础上对ES细胞和神经干细胞进行基因差异表达的比较、筛选和确认等。

ES细胞向神经干细胞分化主导基因确定：分作未知基因探寻和利用已知基因直接转导两种情况。对于未知基因探寻，须将发育不同阶段的ES细胞间配对，并在此基础上与神经源性神经干细胞分别配对，交互抑制削减杂交，以各自杂交产物建立抑制削减文库（cDNA）；再分别用削减混合产物和未削减cDNA混合物反向筛选抑制削减文库，去除假阳性产物；对代表差异的阳性克隆进行测序，生物信息学分析、归类，并以各阶段ES细胞与神经干细胞差异表达的基因结合预先测得已知神经干细胞基因共同点，试制ES干细胞分化调节芯片；再以芯片大量杂交筛选，从中筛选出ES细胞向神经干细胞分化的主导基因。对公开数据库中未有的ES细胞基因用已测的全长cDNA库调控其基因全长，并进行同源对比、功能聚类、组织细胞表达谱等生物信息分析，以初步确定ES细胞向神经干细胞分化主导基因的性质和功能；经表达蛋白和抗体制作研究，进一步确定基因的功能和应用；用制作的基因芯片比较作用前后的干细胞的基因表达，找出基因之间的相互作用和调控机制。对于利用已知基因直接转导，则有可能使ES细胞不必经过神经干细胞阶段而直接被诱导分化为相应的神经细胞（即神经元），如神经元特异性的SOX2基因、调控多巴胺能神经元定向分化成活的Nurrl基因等，都可直接转染ES细胞。对含SOX2基因的真核表达载体或含Nurrl基因的真核表达载体转染至ES细胞后，Western　blot分别检测各自基因在ES细胞中的蛋白表达，同时分别选择性加入或联合RA、EGF、bFGF、IL－1、IL－11、LIF、GDNF等使ES细胞向神经细胞方向直接分化，特别是经联合加入RA等诱导之后，可更易获得表达神经标志的神经细胞或多巴胺能神经元等。

3．信号转导途径调控法　包括Notch信号转导通路、Shc信号转导通路、STAT3信号转导通路调控。在ES细胞等神经干细胞种子源细胞中分别加用相应的激活剂或抑制剂前后，从形态学与功能学角度检查并鉴定经分化后的细胞特性。

4．纳米技术受体变构诱导法　以ES细胞或ES细胞源性神经干细胞向多巴胺能神经元或胆碱能神经元方向诱导分化为例。提纯多巴胺能神经元膜表面的D1／D2受体及胆碱能神经元膜表面的M1－5受体；将D1／ D2或M1－5受体重组在不同发育阶段的ES细胞或ES细胞源性神经干细胞生物膜表面，在溶液中进行SPM高分辨实时成像。通过改变Ca2＋离子的浓度，以及加入激动药（D1／D2受体激动药：SKF38393、SDF82526等；M1－5受体激动药：毒蕈碱、毛果芸香碱等）或者拮抗药 （D1／D2受体拮抗药：SCH23390、SCH39166等；M1－5受体拮抗药：阿托品、东莨菪碱等），观察D1／D2或M1－5受体聚集行为的变化，得出定量的统计数据，并对膜受体蛋白变构前后的ES细胞或ES细胞源性神经干细胞与多巴胺神经元、胆碱能神经元做细胞功能特性方面的比较。

（二）ES细胞培养及神经干细胞的诱导分化

ES细胞（内细胞群、生殖嵴或由克隆技术而获得的早期胚细胞核转移细胞）的培养主要包括三部分工作：饲养层细胞培养，饲养层制备，ES细胞培养。

1．饲养层细胞培养　体外培养ES细胞的基本原则是在促进ES增殖的同时，维持其未分化的二倍体状态。ES细胞一旦分化，即失去其全能性。饲养细胞是与ES细胞共培养时能促进其增殖和抑制其自主分化的细胞。目前饲养细胞有两大类，一为小／大鼠胚胎成纤维细胞（mouse　embryonic　fibroblasts，MEFs；rat　embryonic　fibroblasts，REFs）；二为建细胞系的SIM小鼠成纤维细胞（mouse　fibroblasts）耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系——STO。

（1）MEFs或REFs的制备与培养

①操作缓冲液和饲养层细胞培养液的准备：缓冲液用D－Hank’s缓冲液和PBS缓冲液。

②D－Hank’s缓冲液配置：D－Hank’s缓冲液是一种无机盐溶液和平衡盐溶液（balanced　salt　solutions，BSS），简称HBSS。配制时主要应避免钙镁离子沉淀，D－Hank’s缓冲液由原液A和原液B构成，应用时各取1份原液A、1份原液B和18份双蒸水，混合后在0．15MPa高压蒸汽条件下灭菌15min，以无菌的5．6%NaHCO3调pH至7．2～7．6即可使用。原液A的配法：NaCl　160g，KCl 8g，CaCl22．8g，MgSO4·7H2O　2g，MgCl2·6H2O　2g，以上溶于1　000ml蒸馏水中。原液B的配法：先将Na2HPO4·12H2O 3．04g，KH2PO41．2g，葡萄糖20．0g溶于800ml双蒸水中；再取酚红0．4g放入玻璃研钵中，滴加0．1NNaOH不断研磨直至完全溶解（约加0．1NNaOH　10ml），将溶解的酚红吸入100ml量瓶中（注意洗下研钵中残留酚红液并加入量瓶内），补加双蒸水至100ml，则配成了0．4%的酚红溶液；将已配好的800ml钠钾盐溶液和100m浓度为10．4%的酚红溶液混合并补加双蒸水至1　000ml，则配成原液B。

③PBS缓冲液的配置：PBS即磷酸盐缓冲生理盐水，是在PB（即磷酸盐缓冲液）的基础上加用NaCl制成。PB由A液与B液构成，A液即0．2mol／L磷酸二氢钠水溶液，由NaH2PO4·H2O　27．6g，溶于蒸馏水中，最后稀释至1　000ml而成；B液即0．2mol／L磷酸氢二钠水溶液，由Na2HPO4·7H2O3．6g（或Na2HPO4·12H2O71．6g或Na2HPO4·2H2O 35．6g）加蒸馏水溶解，最后加水至1　000ml而成。以配置0．01mol／L的PBS（pH7．0）为例，取0．2mol／L的A液16．5ml和0．2mol／L的B液33．5ml，加NaCl　18．5g，以蒸馏水稀释至1　000ml，即成通常所说PBS。饲养层细胞培养液的制备用含葡萄糖1．0g／L的Dulbecco’s基础培养基（Dulbecco　minimum　essential　medium，DMEM），添加10%小牛血清以及青霉素100U／ml、链霉素100μg／ml制成。DMEM的配置程序是，先量出溶液总量一半的蒸馏水（如500ml，温度18～20℃）并将标准单位包装的DMEM粉倾入、搅匀溶解；与此同时用另一半蒸馏水冲洗DMEM包装内的剩余粉末并加到上一半的DMEM溶液中，搅到完全溶解透明；每升DMEM加2．2g NaHCO3，或加29．3ml的7．5%NaHCO3溶液，同时也可加入其他补充物（10%小牛血清、青霉素100U／ml、链霉素100μg／ml）；用1N的HCl和1N的NaOH调pH，pH可比所需的高0．1；以蒸馏水补足至最终体积1　000ml；用直径为0．22μm或小于此规格的微孔滤膜滤过消毒。

④消化液的制备：常用的消化液是胰蛋白酶（trypsin，parenzyme）和二乙胺四乙酸二钠（ethylene　diaminetetraacertic　acid，EDTA）两种溶液，主要作用是传代细胞时用以使细胞脱离附着底物表面和离散成单个细胞。胰蛋白酶和EDTA可以各自单独使用，也可按一定比例混合使用。

⑤胰蛋白酶溶液配置：将D－Hank′s液高压消毒灭菌，用NaHCO3调节pH至7．2左右；称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，先用少许消毒的D－Hank′s液调成糊状，然后再补足D－Hank′s液，搅拌混匀，置室温4h或4℃冰箱过夜，并不时搅拌振荡；次日先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱保存备用，胰蛋白酶应用浓度在0．01%～0．5%范围之间，常用浓度为0．25%或0．125%；37℃；消化5mm3大小的胚胎软组织，20～30min即可；胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可调pH至7．2左右。还应注意胰蛋白酶与胰酶（pancreatin）不同，胰蛋白酶是广泛应用的消化物，适于消化细胞间质较少的软组织（如胚胎组织、羊膜等），亦适合用于细胞传代；胰酶则是广义词，除了胰蛋白酶外，还有胰淀粉酶和胰脂肪酶都属于胰酶。

⑥EDTA溶液配置：EDTA溶液又称Versen液，比胰蛋白酶作用缓和，毒性小，对细胞有一定的解离作用；其使用浓度一般为0．02%，很少用于单独消化新鲜组织，与胰蛋白酶按不同比例相混合并用的话，消化作用更佳；EDTA最适用于细胞传代，单用或与胰蛋白酶混用（1∶1或1∶2）均可，但以混用为多。

⑦细胞计数：常用计数板细胞计数法。以96%乙醇冲洗记数板后，擦净，并备一张干净的盖玻片，把盖玻片覆于记数板上，使之微微移向一侧，露出记数板台面少许，以便滴加细胞悬液；取无菌吸管1支伸入培养瓶中，轻轻反复吹打细胞悬液，使细胞充分均匀悬浮于细胞培养液中并立即吸细胞悬液少许，向另一离心管中滴入细胞悬液9滴，再滴入0．5%苔盼蓝1滴，混匀并静置2～3min；将记数板平放在显微镜台上，立即从记数板边缘轻轻滴1～2滴已染色的细胞悬液，使之充满记数板和盖片空隙中，注意勿溢出计数板表面外的小槽内；镜下观察可见细胞分散各处，健康细胞胞体完整，透明不着色（即对苔盼蓝拒染），而凡着色细胞均为不健康细胞；计算四角大方格内的细胞数，对压中线的细胞只计算压左线和上线者，压右线和下线的细胞不计算在内，然后依公式计算：细胞数／毫升原悬液＝（4大格细胞总数／4）×10　000 ×稀释倍数。如果初始稀释度使细胞团数占10%以上，说明消化不充分；细胞数若少于200个／10mm2或多于500个／10mm2时，均说明稀释不当，需重新制备细胞稀释悬液以提高精确度和加快计数速度；计数完毕后可根据所需细胞数量向培养容器中接种，并立即用双蒸水清洗计数板和盖玻片，70%乙醇清洗，擦镜纸擦干，勿使细胞悬液在计数板上干燥。

⑧鼠胚的准备：依涂片法或阴栓法检查确定合笼后雌鼠的孕龄（参见本节前述内容）。取怀孕10．5～14．5d的小鼠母鼠或12．5～14．5d的大鼠母鼠，断颈处死（小鼠）或过量麻醉处死（大鼠）之后，无菌条件下暴露“Y”形双角子宫；以镊子提起宫颈端，分离子宫系膜，剪断子宫角。取出整个子宫，以无菌滤纸吸干血液；置于盛有消毒D－Hank’s液的培养皿中，以相同缓冲液洗2～3次。沿子宫系膜侧剪开子宫，取出带有胎膜的胚胎，置于另一盛有消毒D－Hank’s液的平皿内充分洗涤以除去表面残余红细胞。用显微镊撕破胎膜，取留胎鼠并再用D－Hank’s液清洗。去除胚胎头部、内脏和肢芽；将躯干部置于另一盛有D－Hank’s液的培养皿内，充分洗涤，彻底洗净残余红细胞。

⑨鼠胚胎成纤维细胞的培养：以分离细胞培养法为例。将胚鼠躯干用无菌显微手术剪剪切成1mm3以下碎块，吸于离心管内，室温下静置5～10min，弃上层液；以1ml的0．25%胰蛋白酶与0．02%EDTA混合消化液鼠对胚组织碎块进行消化处理，轻柔吹吸30s，加等体积血清或血清培养液终止消化，室温下静置5～10min；弃上清，留鼠胚组织沉淀物。重复消化鼠胚组织5～6次后，将收集的单细胞悬液离心（1　000r／min）5min。将细胞悬液接种到培养瓶内（由5个鼠胚制备出来的单细胞悬液可使用3个100ml的培养瓶），补加适量培养液，吹吸均匀，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。每日观察并记录。培养2～3d后，细胞连成片即可消化传代（依1∶2～1∶3的比例传代培养），以后每2～3d传代1次。采用第3代至第5代的细胞作为饲养层细胞。

⑩使用MEFs或REFs作为饲养层细胞培养ES细胞是一种最早和常用的方法。MEFs和REFs都能产生抑制ES细胞自主分化和促进ES细胞增殖的因子，故能够有效地促进ES细胞增殖并维持其未分化的二倍体状态和全能性。同时值得提出的是，使用MEFs或REFs时应该注意以下几点：a．种植ES细胞前，如若用丝裂霉素C处理MEFs或REFs，在清洗不彻底情况下可因残余丝裂霉素C（mitomycin　C）的存在而影响ES增殖，须引起注意。b．MEFs和REFs生命期有限，不能在体外长期传代。如若体外传代时间过长，其产生促增生因子和抑制分化因子的能力就会减弱以至消失。由此，以使用第3代至第5代的细胞作为饲养层细胞较佳，此时的MEFs和REFs生长和分泌各种因子能力都旺盛，杂细胞也较少，这就需要经常准备怀孕10．5～14．5d的小鼠母鼠或12．5～14．5d的大鼠母鼠以制备MEFs或REFs。c．在ES细胞培养过程中可能会有死亡的MEFs和REFs释出染色体，后者可能会引起ES细胞的突变及影响正常核型的保持。d．MEFs和REFs都不具有耐药性，不能作为转染外源性基因的ES细胞筛选用。e．获得纯ES细胞作生化和分子生物学方面分析的难度较大。

（2）STO的制备与培养：STO细胞是已建系的SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系细胞，因此可按一般已建系的细胞培养方法进行培养。同MEFs或REFs相类似，它能分泌促ES细胞增生及抑制细胞自主分化的因子，但效果不如MEFs或REFs。作为饲养层细胞使用时，常需在培养液中加入抑制ES细胞自主分化的因子如白血病抑制因子（LIF）。使用STO细胞作为饲养层细胞可免去准备怀孕母鼠的烦琐工作，但仍有可能存在上述MEFs和REFs存在的丝裂霉素C影响、死亡MEFs和REFs释出染色体副作用、不易获得纯化ES细胞等项不足。

2．饲养层制备　一定剂量的丝裂霉素C和γ射线能够使细胞停止分裂而又不至于马上死亡，同时可以在体外存活一段时间并保持分泌各种因子的功能。故使用丝裂霉素C或γ射线处理饲养层细胞，使之终止分裂并仍能分泌可促进ES细胞增生和抑止其自主分化的因子，维持其未分化的二倍体状态。制备饲养层主要有两种方法：丝裂霉素处理法和γ射线照射法。

（1）丝裂霉素C处理法

①实验准备：首先将2mg丝裂霉素C溶解于4ml的PBS中，配置成0．5mg／ml的母液，于4℃条件避光保存；于使用前，用饲养层细胞培养液配成终浓度为10μg／ml的工作液，可于4℃条件下保存不超过1周。除此之外，还需准备0．1%明胶水溶液，将0．1g明胶以100ml超纯水或五蒸水混匀，稍加热溶解后行高压灭菌45min，保存于4℃条件下备用。

②实验过程：当第3代至第5代MEFs、REFs或STO细胞生长连成一片呈细胞单层时，弃培养液，加入含10μg／ml丝裂霉素C的饲养层细胞培养液（覆盖细胞单层即可），在37℃、5%CO2、100%湿度条件的培养箱中作用于2～3h。取另一新培养皿／瓶加入0．1%明胶水溶液，以能覆盖培养皿／瓶表面即可，室温下静置2h以上，使用前吸弃多余的明胶水溶液并以PBS洗涤1次。弃含有丝裂霉素C的饲养层细胞培养液，用PBS充分洗涤3～5次，以除净残余丝裂霉素C和避免其影响ES细胞的生长；消化液消化制成3×105个／ml浓度的细胞悬液，种植到预先用0．1%明胶处理过的培养皿／瓶内（MEFs或REFs的种植细胞数为7．5× 104～1×105／cm2，STO的种植细胞数为5× 104／cm2）。于37℃、5%CO2、100%饱和湿度的培养箱中培养，细胞很快贴壁并铺展为单层。细胞如果过稀可补加丝裂霉素C处理过的细胞，以保证细胞能连成一片而没有间隙；将制备好的饲养细胞单层置于4℃冰箱中备用，在5d内使用，用前需更换成ES细胞培养液。

（2）γ射线照射法：当第3代至第5代MEFs、REFs或STO细胞生长融合成细胞单层时，用30～100Gy（3　000～10　000rad）剂量的γ射线照射。γ射线照射的作用同丝裂霉素C，即能使饲养层细胞终止分裂但仍能分泌促ES细胞增生和抑止其自主分化的因子，以维持其未分化的二倍体状态。照射之后的各步骤，包括消化经γ射线照射过的饲养层细胞，细胞记数、再种植于经0．1%明胶水溶液处理过的培养皿／瓶中，继续培养使细胞再很快贴壁并铺展为单层等，均同丝裂霉素C处理法。

3．ES细胞培养　ES细胞来源及获取：内细胞群、胚生殖嵴、核转移细胞是ES细胞的三大来源。

（1）内细胞群

①实验概况：培养ES细胞的途径之一是将来自胚囊内细胞群的细胞进行多步骤培养。内细胞群的多能细胞以免疫外科手段（即抗体介导的溶解技术）从滋养外培层中分离出来。这些内细胞团被置于含有生长介质的培养皿中进行培养，此培养介质是以鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层，并在饲养层细胞上补充有经过γ射线照射的胎牛血清，γ射线可以阻止鼠胚胎成纤维细胞的复制。培养9～15d后，内细胞团被分离并形成了细胞簇时，可用化学或机械的方法分离并以相同的培养条件继续再培养。在培养过程中可有克隆形成，所形成的克隆就是指来自一个单一细胞的细胞群，这些细胞具有遗传的同一性。经选择、移出纯系克隆并经机械性分离后再培养，使其扩增传代，即可产生一个细胞系。

②操作缓冲液制备：配制PBS。可依前述方法配置。也可取NaCl　8．0g、KCl　0．2g、Na2HPO4·12H2O　2．89g及KH2PO40．2g，用超纯水或无蒸水1　000ml依次溶解；高压灭菌或过滤除菌，室温保存备用。

③ES细胞培养基：以超纯水溶解含葡萄糖4．5g／L的DMEM，补加NaHCO32．2g／L及HEPES　2g／L，过滤除菌，4℃条件下保存备用。使用前添加15%胎牛血清（fetal　calf serum，FCS）、0．1mmol／Lβ－巯基乙醇（βmercptoethanol，β－ME）或0．15mmol／L单硫甘油（monothioglycerol）、2mmol／L　L－谷氨酰胺、青霉素100U／ml、链霉素100μg／ml（可用庆大霉素50μg／ml代替青、链霉素）。

④冲卵液制备：以无Ca2＋、Mg2＋的PBS，添加10%小牛血清、青霉素100U／ml、链霉素100μg／ml而制成。

⑤消化液制备：在1　000ml超纯水分别溶解胰蛋白酶干粉2．5g、EDTA　0．4g、NaCl 7．0g、Na2HPO4·12H2O　0．24g、KH2PO4 0．24g、KCl　0．37g、Tris　3．0g或HEPES 2．0g、D－葡萄糖1．0g以及酚红10mg，于4℃条件下过夜，使之充分溶解。以1mol／L HCl调pH值至7．6。过滤除菌分装后于－10～－30℃下冻存备用。

⑥免疫外科法用液准备：链霉蛋白酶（pronase）溶液的制备，用生理盐水或PSB配置成0．5%的溶液，于－10～－30℃保存备用。兔抗鼠脾脏细胞抗血清，用前以培养液作1∶2　000倍稀释。新鲜豚鼠血清，用前以培养液作1∶6倍稀释。

⑦孕鼠准备及胚胎采集：依涂片法或阴栓法检查确定合笼后雌鼠的孕龄（参见本章第一节内容）。取怀孕3．5～4d的小鼠母鼠或4～5d的大鼠母鼠（此期的胚胎一般处于囊胚期，也可能处于桑椹期，均可作为ES采集使用），断颈处死（小鼠）或过量麻醉处死（大鼠）之后，无菌条件下暴露“Y”形双角子宫；以镊子提起宫颈端，分离子宫系膜，剪断子宫角。分离后的子宫以无菌滤纸吸干血迹后置于无菌平皿内；以1ml无菌注射器吸入冲卵液，由子宫角端进针，确定针头进入子宫腔内，将冲卵液快速推入子宫腔（0．2～0．5ml／侧子宫），则胚胎连同冲卵液从子宫颈端排出。应注意用平皿接好排出的冲卵液。将盛有胚胎冲卵液的平皿置于显微镜下（50～100倍），仔细采集胚胎。

⑧胚胎培养及内细胞群分离培养：一般有普通分离法和免疫外科法（immunosurgery）两种。普通分离法：将直径为3．5cm的培养皿以记号笔划为四等份，于每等份内加入ES细胞培养液成露滴状液滴，每滴直径约0．5cm左右，上覆盖透明石蜡油。此处应用石蜡油有两方面作用，一是防止胚胎培养过程中培养液滴水分的蒸发，二是胚胎换液时需在显微镜下操作，培养液滴上覆盖的石蜡油可以使培养液滴与空气隔开，减少细菌的污染。还要注意购入的石蜡油新产品在使用前不需要高压灭菌，以免增加毒性；回收的石蜡油则要灭菌。将收集的3．5～4d小鼠胚胎或4～5d的大鼠胚胎吸至培养液滴内，于37℃、5%CO2、100%饱和湿度培养箱中培养，每天观察并半量换液换液1次。待胚胎发育为囊胚充分扩展或突破透明带时，移植到制备好的MEFs、REFs或STO的细胞饲养单层上，换上ES细胞培养液继续培养，或移植到无饲养层但加有条件培养液的液滴内（制备同前）。1～2d后，胚胎贴附在饲养细胞单层上，滋养层细胞进一步扩展开并形成薄薄一层将饲养层细胞推开；内细胞群位于中央向上隆起生长，边缘界线清晰，表面较光滑，结构致密（图4－10）。注意隔天换部分培养液，至3～5d内细胞团块增大即可作内细胞群分离和早期培养。对于内细胞群的分离培养，需要首先准备好毛细吸管，将其一端在火焰上拉细（备末端口径比内细胞群稍大和稍小两种）并用砂轮切断末端；之后再取一直径为3．5cm的培养皿并于其内做消化液小滴（每个消化液滴直径0．3～0．5cm，液滴上覆盖一层石蜡油，每个培养皿可做20个消化液小滴）；最后将内细胞群生长良好的培养皿置于50～100倍显微镜下，用末端口径比内细胞群稍大的毛细吸管挑起内细胞群，收集到覆盖有透明石蜡油的消化液小滴内；再将内细胞群吸至另一消化液小滴，于室温或37℃下作用1～5min，改用末端口径比内细胞群小的毛细吸管，轻轻吸吹内细胞群使之分散至3～4个细胞在一起的小团块。接下来，将分散的内细胞群小块吸至准备好的饲养细胞单层上，在ES细胞培养液或其他条件培养基（如神经干细胞培养基等）中进行培养；每日观察，一般在ES细胞培养液中培养2d后可见胚胎样细胞小集落出现，3～4d集落进一步增大，6～7d即可按ES细胞培养方法进行消化传代。

图4－10　培养中的人胚泡（星号示胚泡腔）

（参考引自Institute　for　Stem　Cell　Research，The　University　of　Edinburgh，2003）

⑨免疫外科法：将囊胚充分扩展、内细胞群明显的胚胎移至0．5%链霉蛋白酶液滴中，作用约5min以弃除透明带（或在与显微注射仪上用显微注射针剔除透明带，或进行培养使胚胎自然孵化脱去透明带）；以链霉蛋白酶弃除透明带之后，用PBS洗涤无透明带胚胎3次；用兔抗鼠脾脏细胞抗体处理无透明带胚胎20～30min，并用PBS再洗涤胚胎3次；用新鲜豚鼠血清（补体）处理胚胎，溶解胚滋养层细胞（随时观察，一旦胚滋养层细胞膨大呈透明空泡状则即刻终止处理），PBS再洗涤胚胎3次；将胚胎移回培养液滴内，培养24h。再重新用以兔抗鼠脾脏细胞抗体和豚鼠血清（补体）处理胚胎，弃除残余的胚滋养层细胞；将弃除了胚滋养层细胞的内细胞群移至培养液滴内继续培养，48h后则会有内细胞群生长，3～5d后细胞团进一步增大。以后的处理步骤同普通分离法。

（2）胚生殖嵴的获取和培养：与内细胞群相比，差别主要在于所获胚胎的胎龄与取材部位不同。其他的实验准备与操作基本类似。

一般可从胚龄8．5～10d小鼠、10．5～11d大鼠或5～9周的胎儿组织生殖腺嵴和肠系膜中获得胚生殖嵴细胞即外周生殖细胞（peripheral　germ　cell，PGC）。PEG可被机械的或化学的分离，然后放置于MEFs、REFs或STO细胞构成的细胞饲养层上，补充胎牛血清后进行培养。PGE的培养介质中需要一些细胞因子（如LIF、bFGF、forkolin等）。人类PEG细胞在体外培养1～3周后可形成浓密的、多层的细胞克隆，与鼠的ES或EG细胞相类似。这些克隆的细胞表达SSEA－1，SSEA－3，SSEA－4，TRA－1－60，TRA－1－81和碱性磷酸酶等。而被诱导的细胞克隆有一小部分尚可以不同比例（1%～20%）自发地形成胚胎体。如若从培养基中收集这些胚胎体并检查其细胞型，然后再次置于组织培养皿单孔中继续进行培养14d，则被诱导的PGC胚胎体细胞型范围包括所有三个胚层（内胚层、中胚层和外胚层），说明被诱导的EG细胞是大量的不同细胞型的祖代或前体细胞。

与鼠的ES细胞培养相似，如若人类ES细胞由细胞饲养层中移出并生长在无黏附表面的悬浮培养基中则开始分化。在早期阶段，人类ES细胞形成的仅是简单充满液体的囊性胚胎体。人类胚胎体形成后，这些胚胎细胞可被分离并于具细胞饲养层和细胞生长因子的培养基中进行培养。可以诱导中胚层细胞分化的细胞生长因子有维加酸（RA）、表皮生长因子（EGF）、骨形成蛋白4（BMP4）和碱性成纤维生长因子（bFGF）、转移生长因子－β1（TGF－β1）等；肝细胞生长因子（HGF）和神经细胞生长因子（NGF）则可诱导胚胎体分化成包括外胚层的三个胚层。

（3）核转移细胞：核转移或称核移植（nuclear　transplantation，NT）是利用显微操作的方法，从一个细胞（早期胚胎或卵母细胞）取出细胞核，并与其他细胞（早期胚胎或成体细胞或干细胞）的核进行置换的技术。提供细胞核的一方为核供体，接受细胞核的一方为核受体。根据核供体的区别可分为卵母细胞胚胎互换、胚胎细胞核移植和体细胞核移植。严格意义上说，细胞核移植技术就是克隆技术的一种。克隆源于“clone”一词的音译，指无性繁殖系，或从同一个祖细胞经分裂增殖而产生一个子细胞群的过程，体外克隆技术即为此意；对于分子生物学方面的克隆，则是为获得相同核酸分子产物或分离某一核酸分子片段，以同一核酸分子片段为模板、经扩增而产生碱基序列完全相同的分子产物过程。因此根据操作对象，克隆可以分为个体克隆、细胞克隆和基因克隆。从个体克隆的角度而言，核转移细胞也可成为ES细胞的来源之一，以核转移技术获得ES细胞主要有两种途径。第一，早期胚胎细胞核移植，用16～32细胞期细胞、桑椹胚期细胞或囊胚期的胚泡内细胞群作为供体细胞，以去核成体细胞作为受体细胞培养获得。但该类克隆技术会受到生产效率与实用化之间矛盾的限制。第二，ES细胞核移植，将囊胚期的胚泡内细胞群分离，并用特殊培养基抑制其分化进行传代培养，可保持其全能性的特征。

①供体细胞的准备：供体卵裂球可取自2细胞至囊胚期不同时期的胚胎或体细胞，先用免疫外科法（同前述）或酸性溶液分离细胞、去除透明带。对于细胞之间连接紧密的细胞可用无钙离子培养液做短时间温育，以促进卵裂球分散。体细胞接种并传3～8代之后即可用于细胞核移植，用于核移植的体细胞可以是G0期细胞（即暂不增殖的细胞）、也可以是非G0期细胞。在核移植操作前3～5d，将培养基中的血清浓度降至0．5%进行饥饿培养即可使细胞处于G0期。

②受体细胞的准备：核移植选用的细胞质受体为分裂间期和分裂中期的细胞质，包括M－Ⅱ期（即有丝分裂中期）卵母细胞、受精卵和融合后2细胞胚胎的细胞质，以应用M－Ⅱ期卵母细胞为多。一个细胞的增殖周期包括生长前期（G1）、DNA合成期（S）、生长后期（G2）和有丝分裂期（mitosis，M）。细胞的有丝分裂期又分作前期（Ⅰ）、中期（Ⅱ）、后期（Ⅲ）和末期（Ⅳ），哺乳动物正常细胞的M期最短（0．5～1h）。细胞周期的时间可由激素、生长因子和营养物的浓度以及药物来控制，在离体培养条件下，可通过改变其环境条件使分裂减缓或停止。

③细胞核移植：主要有两种方法，第一种是二次进针法（包括成熟卵母细胞去核、带下注射、电融合步骤）。将M－Ⅱ期卵母细胞去核；再从胚胎中分离卵裂球或消化供体细胞成单个状，将卵裂球或细胞注到卵母细胞或胚胎的卵周隙中；诱导细胞融合与卵母细胞的激活，在体内或体外培养发育；最后将重组胚胎移植给受体直至产子。第二种是受精卵去原核法（细胞核注射）。主要是用玻璃微吸管把细胞核直接注射到受精卵中，并同时吸出原受精卵的核，由于此方法成功率低已基本不用。

④二次进针法核移植操作：共有去核，移核，融合三大步骤。去核可用两种方法：一是透明带切开法（二步法）——将卵母细胞放入覆盖有石蜡油的操作液中，以固定管吸住卵母细胞，用切口针拨动卵母细胞使第一极体位于12点的位置，切口针由上部刺入透明带并经第一极体基部刺穿对侧的透明带，再在固定针的下缘摩擦，使透明带产生一裂口，切开的裂口部分占卵母细胞透明带周长的1／5～1／4。二是一步去核法——以固定管吸住第一极体的对侧，用去核针将第一极体及其下方的核体部分去除，再把核供体移入。包括以下方法：Hochest染色去核法（用含有5～10μg／ml　Hochest　33342的操作液在紫外光照射下呈蓝色的原理，于紫外光照射下去核，但操作时间不能超过15s，以免伤害卵母细胞而影响重构胚的发育）、盲吸和时间控制去核法（先用细胞松弛素B或秋水仙胺处理卵母细胞以使细胞骨架松弛而细胞质膜不易破碎，固定针固定住卵母细胞后即用一直径为25～30μm的尖头斜面微管插入到第一极体处去核，选即将排出或刚刚排出的卵，其卵母细胞染色体紧靠第一极体下方，被除去的可能性最大）、化学去核法［用药物如ETO（etoposide）和放线菌酮处理小鼠的卵母细胞，改变卵母细胞的细胞骨架结构，使染色质与第一极体一起排出以用于核移植］、蔗糖处理去核法［小鼠或大鼠卵母细胞在注射人绒毛膜促性腺激素（human　chorionic　gonadotropin，HCG）12～20h内放入含有2．5%～3%蔗糖的培养基中，3～5min即可看到染色质部位反射强度明显增加，并向卵周隙突起，可于突起部位之上切开透明带，再在含有蔗糖和细胞松弛素B的操作液中去核］、原核激活法（将体外培养成熟的卵母细胞用7%乙醇处理5min，再培养12h，82%的卵母细胞都会有原核出现，通过显微操作即可移去极体下方的染色质和极少量细胞质，此方式去核效率高）、功能性去核法（用特异性染液染核后再使用紫外线照射，使核失去功能）等都属于一步去核的方法。移核则根据供体核移入部位的不同分作带下移植和胞质内注射两种主要方法。带下移植：将供体卵裂球或细胞放在操作滴中，用注射针吸入后，沿去核时留下的孔，移到去核卵母细胞的卵周隙中，并使供体细胞与卵母细胞质膜接触。胞质内注射：胞质内注射时，注射针的内径为5～8μm，先用注射针将供体细胞的胞膜磨破，再将细胞核直接注入卵母细胞质中，通常需于操作后进行激活处理。融合是由于供体核四周有一层完整的质膜，故有必要使核体或卵裂球的细胞膜与受体细胞的质膜融合，以使供体核进入受体细胞，特别是经带下移植操作的卵子更需进行融合处理，使供体核进入受体细胞质中形成重构卵。融合的三种方式包括化学融合［利用聚乙二醇（PEG）处理导致细胞膜融合，融合液含有45%PEG的HEPES缓冲液，处理时间为90s；或先于添有植物凝集素300μg／ml的培养液中预处理之后再移入添加0．9μg／ml　PEG的无蛋白培养液中，37℃条件下处理30～40s以增加融合率］、仙台病毒诱导融合［吸取浓度为2　500～2　600血凝单位（HAU／ml）的病毒悬液，从去核时透明带上留下的小孔插入注射管，将病毒与供体细胞一起注入到透明带下，培养15min后可发生融合，1h可融合完毕］、电融合［在非电解质溶液中由两根平行细微电极组成的融合小室中进行，由直流脉冲所诱发。准确的脉冲电压和持续时间、细胞膜间充分接触使其融合、细胞呈直线排列使电场垂直通过卵／卵裂球界面等，是使融合达到最佳效果的必要条件。电融合的机制是以电刺激使细胞膜形成小孔或细胞膜上的分子重新分布，诱导细胞融合；同时电刺激使细胞内源性钙离子释放，融合液中的钙离子进入细胞内，激活卵母细胞；电刺激使减数分裂促进因子（meiosis　promote　factor，MPF）和细胞刺激因子（cell　stimulation　factor，CSF）失活，从而使卵母细胞进入减数分裂期］。上述三种融合方式以电融合法较为常用。常用的电融合液包括0．27mol／L的蔗糖液、甘露醇液和Zimmermann液等，一般电融合液配置好后可于4℃冰箱保存7～10d。电融合所用的直流脉冲强度和脉程时间可因动物种类不同而异，一般兔为160V／mm　60μs，牛为100V／mm　30μs，绵羊为75V／mm　3×100μs，猪为120V／mm　2×30μs。电融合的参数不仅随着电极间的距离、融合液的种类而异，而且会因卵母细胞的种类、仪器和实验室某种未知因素等均有所不同。

⑤移核后卵母细胞的激活：移植核是随着细胞质环境的改变而变化的。供体核被移植到受体细胞质内后逐渐膨润，前后的大小差异在1h内可达数十倍；移植核的染色质扩散、核仁消失，不久DNA合成开始。因此，为使移植核的卵细胞发育，这个核必须再次回复到近似于卵核的状态，只有这样才能经过与正常相当的发育过程。这种使移植核再次回复到近似于卵核状态的过程即为移核后卵母细胞的激活。常用化学激活和电激活两种方法。一是化学激活法：将接受移植核并经融合的卵母细胞置7%乙醇溶液中，37℃、CO2孵育箱中处理5min或室温下7min，洗净后依以下步骤进行培养，于浓度为5μmol／L的离子霉素（以DMSO溶解，平时于－20℃保存）处理4～5min，以利于快速提高细胞质内的钙离子浓度；再以浓度为5μmol／L的A23187处理5min；在浓度为1．9～2mmol／L的二甲基氨基嘌呤（6－DMAP，以DMSO溶解并于平时保存在－20℃条件下）中3～5h或更长时间，以配合离子霉素和A23187达到最佳激活效果；再于浓度为2μmol／L的Staurospporine中处理15～30min、浓度为5～10mmol／L或1．6mmol／L的SrCl2中处理30～180min（注意该溶液不稳定，需现用现配）；最后以浓度为25mM的三磷酸肌醇（用无钙离子和镁离子的PBS溶解）处理10min；至此，完成了化学激活法。另一种是电激活法：根据在核移植前后的不同时间分为前激活（即在核移植前进行的激活）、融合激活（在核移植行电融合的同时对重构卵的激活）和后激活（在核移植前进行的激活）三种；电激活一般采用的强度为100V／mm，持续时间为50～80μs。

⑥核移植重组胚的体外培养：目前，大多数的体外培养系统都不能很好地维持重组胚胎的体外发育。以兔为例，尽管其重组胚能够在体外培养至囊胚阶段（培养条件及方法参见第1章第一节全胚培养），但移植后的发育率较低，而体内输卵管培养操作复杂、容易丢失胚胎，故应尽量尝试早期的子宫内移植。

⑦克隆胚胎的移植：可以选输卵管移植和子宫内移植。输卵管移植一般选在1～8细胞阶段，可依照胚胎体外发育结果和胚胎数量而定；子宫内移植一般选择桑椹胚或囊胚阶段的胚胎。移植方法与正常体外受精的移植方法相同。

4．ES细胞向神经干细胞的定向诱导分化　对分离培养自内细胞群、胚生殖嵴、核转移细胞的三大来源ES细胞依特殊培养基诱导法、基因转染定向分化调控法、信号转导途径调控法、纳米技术受体变构诱导法获得表达神经标志的神经细胞。原理及要点如前所述。

（三）胚神经组织源性神经干细胞的培养及诱导分化

胚胎组织向神经干细胞的诱导分化并向目的神经细胞的定向分化调控，是胚神经组织源性神经干细胞实验研究的主要内容，而胚神经组织的获取和培养是其首要前提。胚神经组织主要包括神经板、神经嵴、神经管（室管膜）、脑室下区、胚纹状体、海马、大脑皮质等。

1．胚神经组织的获取与培养

（1）神经板、神经嵴和神经管（室管膜）的获取培养

胚龄的确定：神经板、神经嵴和神经管（室管膜）是体外培养神经干细胞胚源性神经干细胞重要的理想来源。根据胚胎发育规律，胚龄为8．0～8．5d的小鼠、10d的大鼠及3周的人胚是神经板、神经嵴和神经管（室管膜）的发育时期。获取早期胚胎神经板、神经嵴和神经管（室管膜）的关键是在确定胎龄的同时，掌握相应时期各结构的发育状态与方位。只有在准确计算胚龄的基础上才能保证取材的成功，胚龄过小，神经板、神经嵴和神经管（室管膜）尚未发育形成；胚龄过大，则脑、脊髓与脑室系统（包括脊髓中央管）已形成。因此胚龄的准确计算至关重要，计算方法详见前述。实践表明，神经板和神经嵴虽然也是胚源性神经干细胞的最佳来源，但因发育阶段较早（小鼠7．5～8．5d、大鼠9～10d、人胚1周）而使结构的分离纯化难度加大，一般不做常规实验材料。以胚龄10．5～14．5d的SD大白鼠室管膜作为神经干细胞研究对象较为合适。

实验主要用液配置：①胶原酶溶液：用Ringer液将胶原酶（153U／mg）配成0．75mg／ml的溶液；Ringer液的配方为7．2g／L　NaCl、0．17g／L　CaCl2、0．37g／L KCl，以蒸馏水配置。②培养液及添加剂：转铁蛋白100μg／ml，氯化钴25ng／ml，胰岛素5μg／ml，生物素1μg／ml，腐胺16μg／ml，油酸10ng／ml，孕酮20nmol／L，α－黑色素细胞刺激素100ng／ml，牛血清清蛋白1mg／ml，前列腺素E110ng／ml，地塞米松39pg／ml，三碘甲腺原氨酸67．5ng／ml，维甲酸35ng／ml，表皮生长因子100ng／ml，α－d－1维生素E　5μg／ml，碱性成纤维细胞生长因子4ng／ml，β－羟基丁酸63μg／ml，2．5S神经生长因子20ng／ml。以上培养液为无血清限定性培养液添加剂配方，基础培养液为L－15CO2培养液，各添加剂的浓度值均为终浓度值。在对上述培养液及添加剂进行配置时，要先将各种成分分别溶解成为干液，最后再混匀，可储存于－80℃冰箱内备用。配方中的大多数成分均可用蒸馏水溶解，但以下几种成分例外：生物素用二甲亚砜（DMSO）配成10mg／ml的干液；前列腺素用95%乙醇配成1mg／ml的干液；三碘甲腺原氨酸用DMSO配成10mg／ml的干液；维甲酸先用DMSO配成17．5mg／ml的干液，再用95%乙醇与L－15CO2培养液1∶1的混合液稀释1　000倍；α－d－1维生素E用DMSO配成5mg／ml的干液。在配就的培养液中，含DMSO为0．11%（V／V）、乙醇为0．07%（V／V）。以直径0．22μm规格的滤膜过滤除菌备用。③完全培养液：为10%胎牛血清（或同种／同体动物血清）与上述无血清限定性培养液混合而成。④培养皿／板包被用生长基质：多用纤维连接蛋白（fibronectin，FN）或多聚赖氨酸（poly－D－lysine，PDL）。FN的配法及使用方法：将人血浆FN（冻干粉）以蒸馏水配制为100mg／ml的干液，储存于－80℃冰箱内备用；使用前以Dulbecco　PBS（配方参见）稀释成250μg／ml，然后加到需包被的培养皿／板内，随后倒出即可。PDL的配法及使用方法：PDL溶液直接以蒸馏水配制成0．5mg／ml的溶液，包被培养皿／板的方法同FN；但须注意的是，以PDL包被的培养皿／板须在室温下自然干燥后再以蒸馏水漂洗。

SD大白鼠神经嵴的获取与培养主要实验过程：①以CO2窒息处死受孕9～10d的大鼠，取出胚胎置4℃Hank’s液中。②室温下利用解剖显微镜切取胚鼠躯干部神经管尾侧端约10个体节长的组织条，并将组织条暂存于4℃Hank’s液中。③37℃、5%CO2培养箱内用胶原酶溶液消化处理组织条20min；取出后轻轻研磨组织条至神经管暴露清晰，体节及脊索脱落为止；以4℃含胎牛血清的MEM培养基洗涤组织条3次以抑制胶原酶活性。④将神经管植块种植于预先用纤维连接蛋白（fibronectin，FN）包被的培养皿（直径60mm）内，注意在接种前用含血清的培养液漂洗培养皿；⑤置CO2培养箱内使组织块贴壁30min，之后加入完全培养液、继续培养24h；当神经嵴细胞从神经管植块迁移出来到生长基质表面以后，于倒置显微镜下操作，由培养皿中小心挑去神经管植块，留下神经嵴细胞；⑥以0．05%胰蛋白酶溶液在37℃条件下，消化培养皿中的神经嵴细胞3min，并以含血清的培养液终止胰蛋白酶活性；⑦离心（2　000r／min）4min，以1ml的完全培养液将细胞沉淀重新悬浮；⑧每个培养皿（直径100mm）种植细胞约225个，加入完全培养液后继续于CO2培养箱内培养，即得到神经嵴细胞源性神经干细胞。除神经嵴之外，胚龄10．5～14．5d的SD大白鼠室管膜也是作为神经干细胞研究的合适对象。

SD大白鼠胚室管膜的获取与培养主要实验过程：选孕龄10．5～14．5d的孕鼠胚胎为实验对象。①孕鼠麻醉。②孕鼠仰卧位行腹部“V”形切口、剖腹取出含有串珠样胚胎着床的“Y”形双角子宫。③冰D－Hank’s液冲洗，解剖学显微镜下切开子宫并剥离、去除胎衣，获得鼠胚。④在胚鼠背侧由浅入深层层剥离直至暴露脑泡和神经管，于相当于胚体背侧中轴部位纵向由头端至尾端剖开，以神经管为辨认标志，由头端的脑泡内层或脊髓端的神经管内层获取胚室管膜组织，置Hank’s液中。注意勿将眼泡与胚头相混淆，也勿将神经管与体腔相混淆。⑤0．25%胰蛋白酶·0．02%EDTA消化，10%胎牛血清终止消化。⑥细胞计数并行细胞活力检测，以大约1×107个细胞／ml浓度将细胞接种于培养基（培养基的基本成分可以采用低糖DMEM／F12，其他添加剂根据各自实验所需调配加减使用）。⑦置5%CO2孵育箱连续培养并适时观察，并根据需要而调整培养基条件。

操作原则及注意事项：①取材快速、手法轻柔、定位准确、严格无菌操作；②取材尽可能在冰上操作，以减少组织细胞溶解破坏；③操作中尽可能将软脑膜／软脊膜剥离干净，更不能将其他软组织带入脑泡或神经管；④追踪观察培养细胞的生长情况并根据需要及时调整培养条件，记录实验结果（图4－11，彩图12）；⑤细胞活力检测：以拒染0．5%苔盼蓝细胞的百分率表示，即细胞活力＝每镜下视野100个细胞中拒染0．5%苔盼蓝的细胞数×100%，拒染率越高则提示细胞活力越佳。

图4－11　胚鼠室管膜源性神经干细胞生长分化情况

注：a．细胞接种于培养皿0h，圆形细胞悬浮（相差，×400）；b．细胞培养16h，细胞出芽或所形成的胞突相互连接成网（相差，×400）；c．细胞培养72h，部分细胞的胞体明显增大、细胞出现分裂，可形成由多个细胞组成的神经球结构（相差，×400）；d．细胞培养7d，细胞球进一步分化出一些有突起细胞，可见突起增长并相互连接、交织成网（相差，×400）
（参考引自姜晓丹，徐如祥，廖可立，等．中华神经医学杂志，2002；1（1）：41－44）

（2）其他胚胎神经组织的获取培养

除了胚室管膜之外，神经干细胞诱导分化实验常用的胚胎神经组织有胚胎纹状体、海马、室管膜与脑室下区、大脑皮质等。

胚神经组织获取与培养的实验过程以及注意事项大体同胚室管膜实验。以SD大白鼠胚脑海马的获取与培养为例，与胚室管膜实验的不同点在于：①孕龄14．5d以上的孕鼠胚脑发育日趋完善，结构更加清晰，因而容易辨认与准确定位取材。②获得鼠胚之后的取材方法与胚室管膜实验略有不同：经胚鼠头端背部撕开头皮并轻轻揭去尚未发育成熟的颅骨，由颅底剪断所连接脑神经，取出完整大脑；以2把显微镊仔细剥离软脑膜；在相当于颅脑前1／3部位冠状切开脑组织，根据解剖结构辨认并获取海马组织（或其他胚脑组织如胚纹状体、脑室下区、大脑皮质等）。③0．25%胰蛋白酶·0．02%EDTA消化，10%胎牛血清终止消化；或将胚脑组织剪碎后以机械吹打法制成单细胞悬液，过400目滤网。以后步骤包括细胞计数并行细胞活力检测、细胞培养条件等步骤同胚室管膜实验。

2．胚神经组织源性神经干细胞向目的神经细胞的定向分化调控　与ES细胞向神经干细胞定向诱导分化一样，特殊培养系统、基因调控、信号转导、纳米技术都成为胚神经组织源性神经干细胞向目的神经细胞定向分化调控的有效手段。不同的是，诱导分化的对象由ES细胞向神经干细胞的定向诱导变成了神经干细胞向不同目的神经细胞的定向诱导分化，因此主要需注意比较对象选择的转变。例如，应用基因调控法行神经干细胞向目的神经细胞的定向分化调控，就是要在对发育不同阶段神经干细胞间配对的基础上，再将神经干细胞与目的神经细胞（如多巴胺神经元、胆碱能神经元等）分别配对，交互抑制削减杂交并以各自杂交产物建立抑制削减文库（cDNA）。其他则同前述的由ES细胞向神经干细胞定向诱导方法。

三、神经元的鉴定

（一）标记物及鉴定

主要包括神经干细胞及神经元的标记物。以免疫组织细胞化学或免疫荧光化学的实验方法即可对神经干细胞及其分化的神经元进行初步鉴定。表4－4列出了一些常用主要标记物。

表4－4　常用鉴定神经干细胞及分化细胞类型的特异标记物

（续　表）

鉴定干细胞特殊群体常将荧光的化学特征与神经干细胞或其分化的神经细胞表面受体独特结构联合起来应用，涉及的方法主要有荧光激活细胞分选法和细胞（荧光）标记物鉴别法两种。荧光激活细胞分选法（fluorescence　activated　cell　sorter，FACS）是将含有荧光标记细胞的悬液在压力下以单细胞形式通过一狭窄的喷嘴，在细胞通过的喷嘴处有激光光源作为必经之路，之后再通过电场；由于荧光细胞带负电、而非荧光细胞带正电，因而可利用这种带电差异分选出相应的细胞。细胞（荧光）标记物鉴别法则是以（附有荧光标记物的）信号分子作为相应细胞标志物，其荧光标记物可在荧光显微镜下被特殊光能或化学反应激活而使相应细胞被检测出来。

也有用分子生物学技术（如PCR、RTPCR技术等）鉴定神经干细胞或其所分化神经细胞的特征性遗传标记物，包括鉴定细胞特有基因和转录因子等。例如，将绿色荧光蛋白（green　fluorescence　protein，GFP）的报告基因插入神经干细胞中，由于该基因仅于细胞未分化时被激活或报告、一旦细胞分化时则关闭，因而当被激活时则该基因指导神经干细胞产生发有绿色荧光的蛋白质，由此再结合FACS和显微镜观察即可分选出神经干细胞或鉴定与跟踪其在组织内的生存及分化情况。

此外，免疫磁珠筛选法也是利用特异的细胞标记物与免疫学技术相结合而对神经干细胞或其所分化神经细胞进行筛选，其主要原理是利用包被了单克隆抗体的免疫磁性微粒与靶物质特异性结合，使结合后的磁珠细胞复合体具有磁顺应性，在外加磁场的作用下被滞留在磁场中，从而与其他非磁性成分分离，达到纯化的目的。该技术的两大部分是免疫磁珠和磁场，其中免疫磁珠是由免疫配基包被载体微粒形成的，这种结合并不改变配基原有的生物学特性。

尽管如此，目前还没有绝对特异的干细胞标记。最近有研究显示，ABCG2／Bcrp1基因可作为“通用的”干细胞标记。这个基因在不同来源的干细胞中都以一种高度特异性形式表达，而大多数成熟细胞则对其不表达，因此它将成为干细胞标记，提示新发现的ABCG2／Bcrp1基因将为干细胞研究提供更精确的鉴定方法。

（二）选择培养鉴定法

此方法是基于神经干细胞增殖分化特性，以特殊培养条件对神经干细胞进行选择性分离培养。最为常用的体外获得神经干细胞的方法是将中枢神经系统（central　nerve system，CNS）来源的组织用酶消化法或机械方法分离成单细胞悬液，培养于含有有丝分裂因子等特定条件的培养基中。最主要的两种有丝分裂促进因子是表皮生长因子（epidermal　growth　factor，EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basic　fibroblast　growth　factor，bFGF）。由于非干细胞存活时间短，在干细胞培养条件下很快死亡，所以可以将分离出来的神经干细胞进行长期的选择性培养，2～4周后筛选出存活细胞进行多次细胞传代，即可获得纯化的神经干细胞。

一般情况下，神经干细胞可以两种生长方式在体外进行扩增，一种是干细胞贴壁培养，细胞在二维环境中生长，此时的CNS干细胞形成大的神经球（neurospheres）结构，内含少量神经元、胶质细胞和大量的神经干细胞；另一种则是在三维环境中呈悬浮的神经球扩增，在悬浮培养状态下形成悬浮生长的多细胞混杂神经球。用后一种方法，可在EGF存在的条件下持续培养漂浮状态下的神经干细胞，使细胞增殖、并不断由同一来源的单一神经干细胞形成神经球，从而达到神经干细胞扩增的目的。这些细胞都能对Nestin和Musashi1这两种神经干细胞高选择性标记物呈阳性反应，提示确实属于未达终分化的神经干细胞；若除去EGF再接种于涂有黏着剂平皿中，则神经细胞球细胞在培养皿上向周围游走的同时，还可分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，表明其具备向神经组织细胞多向分化的潜能；该细胞球也可以传代，各代细胞仍可分化生成上述三类细胞，显示出自我复制能。由此，利用这种选择性培养法，即可在对神经干细胞浓缩、增殖的同时达到鉴定的目的。

除了neurosphere方法以外，还有一种以培养皿行低密度培养的神经干细胞选择培养法，主要是将含有胚胎大脑神经元及神经胶质细胞的上清培养液再以低密度培养，可有大致7%的克隆分裂为数百个细胞，其中约40%可分化为神经元、少突胶质细胞和星形细胞；而再次低密度培养散在的克隆细胞则可再次显现出克隆细胞的自我复制性。这种细胞培养方法特别适用于细胞分化流程图分析，以及对决定细胞命运的不同因子鉴定分析。

（三）神经干细胞分化后产物鉴定反推判断法

无论由何组织／细胞来源的神经干细胞，在从事进一步的实验研究和临床应用前期实验之前都需要进行鉴定确认，以保证神经干细胞的可靠性。神经干细胞的鉴定可分为体外鉴定与体内鉴定，体外／体内鉴定又包括形态学鉴定和功能鉴定。

1．体外形态学鉴定

（1）形态学观察　未分化的神经干细胞主要以两种形式存在，一种是散在分布生长的神经干细胞，细胞大而圆且呈良好的活力状态；另一种是形成神经球的神经干细胞，呈岛屿状存活，边缘清楚，表面平滑，结构致密，隆起生长，组成细胞球的细胞圆润饱满呈较佳活力状态，细胞间边界有的清楚、有的则因细胞正处分裂期致使细胞之间呈未断开状（图4－12a，b，c，彩图13a，b，c）。判断时需注意的是，有些胚脑神经组织源性神经干细胞的生长发育会于类脂滴状的液化胚脑组织覆盖下进行，须仔细鉴别（图4－12d，彩图13d）。

图4－12　神经干细胞球的生长

注：a，b，c成人骨髓源性神经干细胞球形成　×400；d．胚脑神经组织源性神经干细胞形成　×100

（2）特异性检查：包括碱性磷酸酶染色、端粒酶免疫组化检测、神经干细胞特异性／高亲和性标记物［如Nestin、CD133、波形蛋白（Vimentin）、Musashi－1等］免疫细胞／组织化学检测等。

①碱性磷酸酶染色：未分化的神经干细胞除具有神经球形成（即神经干细胞细胞克隆形成）之外，表面标记碱性磷酸酶也呈阳性；而神经干细胞一旦分化，则碱性磷酸酶呈阴性。碱性磷酸酶在ES细胞中有明显的阳性表达，并非为神经干细胞的特异性表达。因此可经碱性磷酸酶的检测，结合克隆形态观察，来判断神经干细胞是否分化。碱性磷酸酶在碱性条件下（pH9．0～9．6）能使孵育液中的α－磷酸萘酚钠水解，产生萘酚，然后再与偶氮盐耦联，生成不溶性耐晒染料而呈现颜色。检测时，将神经干细胞种植在放有用明胶预处理过的无菌盖玻片的培养皿内，培养24h；取出已生长有神经干细胞及其克隆的盖玻片，用无水乙醇或4℃预冷的丙酮固定10～15min；蒸馏水轻轻冲洗；将孵育液直滴加于盖玻片上（孵育液组成与配制：α－磷酸萘酚钠35mg、坚牢蓝B盐或偶氮盐35mg、0．5mmol／L的Propamediol缓冲液35ml，混匀后用滤纸过滤使用），室温下作用5～10min；流水轻轻冲洗约10min；将复染液（2%甲基绿水溶液）加于盖玻片上复染10min；流水轻轻冲洗，晾干，树胶封片。观察时注意，未分化的神经干细胞克隆颜色依所用偶氮盐品种而异，分化的神经干细胞克隆颜色则呈复染液颜色。

②端粒酶免疫组化检测：像ES细胞一样，神经干细胞也能表达高水平的端粒酶，这种酶能帮助保持端粒的稳定性，保护染色体的末端。端粒酶活性和长的端粒是在胚胎组织中增殖和形成生殖细胞或在胚神经组织中进行细胞增殖的特点。端粒酶的活性检测也可根据PCR－ELISA法进行。

③神经干细胞特异性／高亲和性标记物免疫细胞化学或免疫组织化学检测：对所培养细胞在不同阶段进行免疫细胞／组织化学鉴定，目的在于明确培养细胞所表达的特征性表面抗原标志。神经干细胞的标记物主要有如Nestin、CD133、波形蛋白（vimentin）、Musashi－1等（表4－4）。免疫细胞／组织化学检测可用改良SABC法完成。

SABC操作步骤：培养细胞经2%戊二醛或4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脱水，以0．01mol／L的PBS（pH7．4）漂洗3次；用4%山羊血清（1∶50）37℃条件下孵育30min；滴加一抗（分别选择Nestin、CD133、波形蛋白、Musashi－1等标记物抗体，注意效价准确）4℃孵育过夜，0．01mol／L的PBS（pH7．4）漂洗；滴加生物素化二抗37℃孵育1h（注意与一抗之间的种属对应正确，例如，如果一抗为小鼠抗大鼠Nestin，则二抗需选羊抗小鼠的IgG），再用0．01mol／L的PBS（pH7．4）漂洗；滴加链霉亲和素－生物素－酶复合物（Strept　Avidin－Biotin　peroxidase　Complex，SABC）（效价1∶200），37℃孵育1h，以0．01mol／L的PBS（pH7．4）漂洗干净；DAB显色处理：依试剂盒说明进行：取蒸馏水1ml，加试剂盒中A、B、C成分各一滴，混匀后，滴加至上述处理的细胞标本上；室温下显色，镜下控制反应时间，至显色满意时（一般15～30min）；加蒸馏水终止反应。脱水、透明，树胶封片。免疫细胞／组织化学检测时，注意阴性对照和阳性对照的设定和参照。

（3）分化细胞标记物检测反推证明法：是指对拟认定神经干细胞的细胞检测在分化为有突起细胞后（即神经元样细胞或神经胶质细胞样细胞），其有突起细胞是否表达神经元特异性烯醇化酶（NSE）或胶质源性纤维酸性蛋白（GFAP）等特异标记物，而反推断有突起细胞的亲代干细胞为神经干细胞（而不是其他类干细胞）的方法。神经元及神经胶质细胞标记物参见表4－4；免疫细胞／组织化学检测方法步骤同上述。

2．体外功能学鉴定

（1）对由神经干细胞分化为神经元样细胞的膜片钳检测。

膜片钳技术（patch　clamp　recording technique）是以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一（或多个）离子通道分子活动的技术。该技术用微玻管电极接触细胞膜，以吉欧姆（GΩ）以上的阻抗使之封接，致与电极尖开口处相接的细胞膜小区域（膜片）与其周围在电学上绝缘，并在此基础上固定电位，对膜片离子通道的离子电流进行监测记录。在对神经干细胞功能检测时，可以应用该技术检查并比较由神经干细胞分化为神经元样细胞的细胞膜与神经组织内原有神经元细胞膜是否有相一致或类似的膜离子通道（如Na＋、K＋、Ca2＋通道等），电生理测定分化为神经元样细胞的膜电位情况。以膜片钳不仅可以观察细胞膜的单离子通道，而且有多种模式可以对细胞进行电压钳制和电流钳制，观察各种离子通道电流及其调控。

实验的准备：①微玻管电极的准备。用作微电极的玻璃有两种类型，苏打玻璃（属软质玻璃）和硼磷酸盐玻璃（属硬质玻璃）。电极分两步拉制而成，第一次拉长7～10mm，使玻璃管中部直径小于200μm，拉出的形状取决于拉制时的长度和加热线圈几何学，拉制越长则直径越小；线圈距离长则玻璃管受热段长，同样的拉力强度就得到尖端更大直径的电极。在此基础上可进行第二次拉制，即重新调好电极的中心位置，减少加热线圈的电流。电极尖端直径主要取决于加热线圈，加热电流小则断开时直径大，一般情况下，如若采用稳流源使电流稳定变化在5%以内，则硬质玻璃常用10．2A电流，软质玻璃常用9．0A电流；玻璃管在中段断成两根电极，断开处尖端直径1～2μm。两步拉制电极的目的主要是使电极前端的锥度变大，狭窄部长短缩短，这样可以降低电极的串联电阻。最后还要对电极冲灌，就是利用毛细管作用或吸入作用由尖端吸入电极内液，然后再用微量注射器反向冲灌，冲灌后如有气泡滞留在电极尖端附近，可用手指轻轻弹击电极下段即可除去这些气泡。为了减低从膜片电极和溶液之间的浮游电容在膜表面所产生的噪声水平，常常在尽量使用薄壁电极的同时酌情在电极涂抹硅酮树脂，多使薄壁电极尖端裸露1mm左右，而对与溶液相接触的部分进行硅酮树脂涂抹处理。②电极内液的准备：不同的实验目的使用不同成分的电极内液，电极内液的基本要求是等张的KCl溶液。在细胞内的生理条件下，pH值约等于7．0，钙离子浓度为10～100nmlo／L。可用HEPES等缓冲液、钙离子螯合剂（如EGTA）进行调节。用于全细胞记录的电极内液主要有制霉菌素（nystatin）电极内液，因制霉菌素属多烯类抗真菌药，在细胞膜上形成的孔径约0．8nm，可有效防止大分子的胞浆活性物质被稀释，且不会通过细胞膜进入细胞内干扰细胞内的生理及生化过程。制霉菌素电极内液的配制方法如下：首先配储备液（取5mg制霉菌素，溶于50～100μl的DMSO液中，在－20℃条件下低温保存备用，可储存1～2个月）；之后配电极内液（标准电极内液组成为：KCl　140mmol／L、EGTA 0．5mmol／L、HEPES　5mmol／L，pH7．2）；于0℃和避光条件下，取少量储备液，用以上电极内液释至20～100μg／ml。也可直接用甲醇新鲜配制出制霉菌素液5mg／ml，然后再用标准电极内液稀释至所需浓度，常需用超声振荡器助溶，且甲醇储备液在冰箱中仅能储存3d，需注意。新鲜配制的稀释液在2～3h内应用有效。一般用10～20μl稀释液灌注电极尾部，如果备有电极内液换液系统则可在普通电极液形成贴附式膜片钳后，利用换液系统使稀释液替代普通电极内液。③实验系统的连接：膜片钳放大器和探头是实验系统的核心，探头与微电极相连作为信号的输入端。还需连接可编程的信号发生器或刺激器；示波器作为输出设备监测钳制信号和离子电流信号；放大器的电流输出可直接输入磁带记录仪储存，以备实验后分析。实验的结果需记录打印输出设备。对膜片钳放大器输出信号的采集、显示和处理是膜片钳技术的重要组成成分，也是膜片钳技术发展的重要标志。

主要实验过程：电极与细胞膜形成贴附式模式后4～5min，制霉菌素即可扩散到膜上起作用。此时，每隔3～5min必须要监测电容与串联电阻，可观察到慢电容充电电流随时间逐渐变大，5～10min基本达到稳态。如若串联电阻小于50MΩ，即可使用膜片钳放大器上的串联电阻补偿，并对细胞进行电位或电流钳位。

（2）对由神经干细胞分化为神经元样细胞的类神经递质生化物质测定。

应用免疫组化及高效液相色谱仪分别定性、定量检测由干细胞分化为神经元样细胞的生物活性（如兴奋性氨基酸、抑止性氨基酸、多巴胺、乙酰胆碱、5－HT等），从而推断神经干细胞的可靠性。高效液相色谱仪一般由高压泵、梯度控制器、进样器、色谱柱、检测器（紫外检测器、荧光检测器、电化学检测器等）及积分仪等主要部件组成。有工作站的高效液相色谱仪可自动控制及数据分析处理。高效液相色谱法按固定相的状态可分为液－液色谱（LLC）、和液－固色谱（LSC）两大类；按分离原理可分为分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、及凝胶色谱四种类型。该方法应用范围极广，特别是在神经科学领域，只要求样品能制成溶液，对高沸点不挥发性的、热不稳定的以及高分子量的化合物（如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、皂甙、类脂、激素或无机盐等）均能以高效液相色谱法进行分析。

实验准备：①选择适合分析样品的液相色谱条件（包括检测器及固定相（分析柱）的选择、流动相（pH、有机相／无机相）的选择、分析环境（温度、流速）的选择等）；②确立样品预处理方法及最后进样体积；③设定分析参数（衰减度、走纸速度、打印格式）；④确定保留时间，建立标准曲线，以便对样品进行定性、定量分析。以上准备缺一不可。

主要实验过程：根据待测指标选定标准品并建立稳定的标准曲线；将待测样品（研磨后的由神经干细胞分化来的神经元样细胞匀浆液标本）以进样器加入已选择的流动相中；样品中不同的待测生物活性物质随流动相通过色谱柱，并因分子量或其他特性的不同而呈不同时间差被梯度洗脱分离出来；不同生物活性物质先后由检测器收集、分析、放大，并形成相应的色谱图。

结果分析：①定性分析：主要依据的是样品中各组分的保留值。在一定的分离场和恒定的色谱条件下，不同物质有不同的保留值，相同物质保留值相同，一般不受其他因素的影响。常用有两种定性方法，一种是绝对保留值定性，即利用已知标准品保留值验证样品中相同的物质；另一种是已知物品加入法定性，是将已知标准品加入到样品中，利用峰高的变化进行定性。②定量分析：有内标法和外标法两种方法。内标法：选择合适的内标物相当困难，故多不用。定量校正曲线法也称外标法，是利用倍比浓度的标准品在固定的色谱条件下得出校正标准曲线并求出线性方程，在相同色谱条件下分析样品，用线性方程求出样品组分含量的方法。

（3）采用纳米（胶体金标记技术）研究神经干细胞、功能神经细胞膜脂质双分子及细胞骨架改变，比较、了解膜功能状态及细胞内信息传递变化。原子力显微镜为主要技术手段。

3．体内形态学鉴定　主要是涉及移植后神经干细胞在体内的整合分化情况鉴定。在动物实验，可于移植前对拟移植神经干细胞进行标记（BrdU或GFP等），主要标记神经干细胞的DNA，以便在移植后于体内存活一段时间，再进行检测时便于与宿主体内自身细胞相区别。动物实验的标记神经干细胞在体内存活一定时间之后即可处死动物，进行光镜或电镜标本切片制作，并于镜下检测，再根据细胞标记对包括移植后神经干细胞在动物体内或人体内的切片。

神经干细胞移植到人体后的形态学鉴定，除了活检方法外，至今尚无其他更好的办法，况且细胞标记对活体的影响也无法肯定，因此该项指标并不适合实际应用于人类。而正电子发射扫描影像法（PET）可被用于人类活体的无创检测。

4．体内功能学鉴定　主要涉及神经干细胞移植到体内并经整合分化后的功能发挥情况鉴定。对于人体神经干细胞移植的客观功能评估，主要须借助于PET方法。对动物神经干细胞移植的客观功能评估则需依赖于模型动物移植前后的各项指标比较。

以大鼠部分常用病理模型应用神经干细胞做神经功能修复实验为例。

（1）动物模型制作

①帕金森病（PD）动物模型

动物模型制作。一侧中脑黑质注射6－羟基多巴（6－OHDA　0．2%6μl）。

注射定位坐标：Paxnos　G（1986）大鼠大脑立体定位图谱：

AP－4．8mm，MR1．6mm，DV　8．2mm，TB－3．3mm。

模型成功标准　黑质损毁术1周后开始每周一次皮下注射阿朴吗啡（0．5mg／kg），检测大鼠的诱发旋转行为。以国产小动物旋转行为记录仪连续40min内分别记录大鼠向损毁侧和对侧的旋转圈数，大鼠每旋转360°为1圈。阿朴吗啡诱发大鼠向损毁对侧旋转＞280r／40min、并连续4次以上者判定为合格模型鼠。

②阿尔茨海默病（AD）动物模型

动物模型制作：采用侧脑室内注射选择性胆碱能毒剂AF64A（Ethylcholine　mustardaziridiumion）或采用海人藻酸（KA）海马内定位注射（注射靶点为：AP3．0mm　ML2．2 H2．9mm）方法，制作SD大鼠AD模型。

模型成功标准　Y迷宫行为学检测：

大鼠放入迷宫适应5min，使其对Y迷宫三臂均探索进入，之后由I臂开始随机次序变换测试（电压40V，给电5s）。电击后大鼠逃避至安全区为正确反应，否则为错误反应。每测一次休息30s，测10次休5min。大鼠学习获得能力以连续10次测试中有9次正确反应所需电击数表示。阿尔茨海默病模型动物在获学习能力迷宫训练中所需的电击次数明显增加。

③脑损伤致昏迷、偏瘫模型

动物模型制作　火器伤动物模型以滑膛枪定距离脑干网状结构方向射击制成（7．62mm弹颅穿透伤）；

撞击伤模型以自由落体砝码定重量、定距离，硬脑膜外冲击大脑皮质制成。

动物昏迷标准 　排除常规麻醉剂量下动物6h以内入眠状态，6h后动物仍无自主运动；

四肢弛缓状态，对疼痛等外界刺激的防御反射消失；

血压下降、脉搏微缓，大小便失禁。

动物偏瘫标准

0级　无缺损体征；

1级　受伤脑对侧前肢屈曲；

2级　对来自受伤脑侧推力的抵抗减弱，但无旋转运动；

3级　对来自受伤脑侧推力抵抗减弱的同时，出现向瘫痪侧的旋转运动。

（2）神经干细胞模型动物移植实验

①以试管收集已达最佳活力状态的培养神经干细胞（神经干细胞的取材诱导及培养见前述）。

② 以培养基混悬成细胞悬液，取样本以苔盼蓝染色计数，要求细胞数量级不低于1 ×106／ml个，拒染活细胞＞80%；将达到标准的细胞加入细胞标记物BrdU（终浓度10μg／ml）进行共培养3～7d；或依最佳病毒感染指数（MOI）为105的标准计算、加入包装了绿荧光蛋白（GFP）的腺相关病毒（rAAV）病毒颗粒，连续培养12h以感染细胞，再补加10%胎牛血清后，于神经干细胞培养基中继续细胞培养24h以上；对计划进行移植后做超微结构观察的神经干细胞则需做免疫胶体金（直径≤5nm）；标记细胞均留待移植用。

③再收集离心（1　000r／min）10min。

④去上清，以无菌生理盐水洗2～3次。

⑤将神经干细胞悬浮于0．3～0．5ml的生理盐水中，保证神经干细胞数≥1×106个细胞／ml。

⑥经立体定向技术准确地分别将神经干细胞移植于不同模型动物的相应脑区（PD模型：移至黑质纹状体；AD模型：移至海马；脑损伤：移至损伤组织周围；昏迷：移至尾状核头部）。

（3）神经干细胞移植的几种常用方法

①细胞悬浮液立体定位注射法。

②胶原基质包埋法，以胶原基质内加入能缓慢释放神经营养因子的可吸收分子生物材料为宜。

③生物材料（PGA、PLA等）吸附移植法。

（4）定期观察比较神经干细胞移植前后模型动物体征变化，并记录分析。

（5）被移植细胞将整合到脑组织并逐渐发挥效应。可依实验需要，于神经干细胞移植后分别观察活体监测指标和不同时期处死动物后取材的各项客观指标。于移植后7，21，70，90，180和360d采取脑标本观察移植细胞的成活，移植功能细胞与周围脑组织细胞间突触联系是否建立，免疫组化检测移植功能神经细胞合成多巴胺（PD模型）Ach（AD模型）等情况，活体观察动物行为功能恢复状况。

关于人自体神经干细胞移植修复脑神经功能损害的临床应用。对临床志愿者术中取出的碎片脑组织或所抽取的自体骨髓经分离培养、诱导分化获得神经干细胞后，再行定点或多位点注射移植，观察患者神经功能恢复情况及脑部受损区域代谢改善情况。神经干细胞的移植注射需在立体头架、导航系统等配合使用下于临床手术室进行。观测指标主要以个体症状体征改善情况结合PET、ECT、脑电图等检查鉴定为主。须注意以下几点，一是神经干细胞治疗的临床前试验安全性评估：至少完成三项临床前试验。①致瘤性实验：体外－软琼脂克隆实验，体内－裸鼠皮下接种实验，以确定该神经干细胞无致瘤性。②毒性实验：将临床病员神经干细胞输入裸鼠观察毒性反应、过敏反应、局部刺激反应等。③免疫实验：以裸鼠作为研究客体，结合毒性实验、再从免疫学角度观察临床病员神经干细胞在裸鼠体内的存活时间，为安全可靠性提供依据。二是有效性评估：①通过高压液相色谱法进行递质类活性物质测定以评估神经干细胞在移植后可能的递质分泌状态；②通过体外进一步诱导神经元形成、膜片钳测定神经兴奋，评估神经干细胞的潜在分化功能；③以前期动物实验为主要参考依据，评估神经干细胞对脑功能损害病理模型修复功能的可行性和有效性。

（南方医科大学珠江医院　姜晓丹　徐如祥）

参　考　文　献

1　蔡文琴，李海标 ．发育神经生物学 ．北京：科学出版社，1999

2　陈　军，李继硕 ．膜片钳实验技术 ．北京：科学出版社，2001

3　陈系古，潘兴华，黄　冰，等 ．多能干细胞分离培养及应用．中山医科大学，2000

4　丹 羽章，伊井一夫，梅田 誠，等。組織培養の技術 ．第3版 ．东京：日本朝倉書店株式會社，1997

5　鄂　征 ．组织培养和分子细胞学技术 ．北京：北京出版社，1999

6　堀尾武一。分子細胞生物學基礎實驗法。东京：日本南江堂株式會社，1994

7Millband　David．Embryonic　Stem　Cells．Institute　for　Stem　Cell　Research，The　University　of Edinburgh，2003

8　施新猷 ．现代医学实验动物学 ．北京：人民军医出版社，2000

9Thmson　JA，Itskovitz－Eldor　J，Shapiro　SS，et al．Embryonic　stem　cell　lines　derived　from　human　blastocysts．Science，1998；282：1145－1147

10 汪　谦 ．现代医学实验方法 ．北京：人民卫生出版社，1997；

11 薛庆善 ．体外培养的原理与技术 ．北京：科学出版社，2001；

12 张文治，苏　心，秦进喜，等。细胞因子对神经干细胞增殖和分化的影响 ．临床与实验病理学杂志，2003；19（1）：77－81