一、胶原组织检测
胶原是软骨基质的主要成分，对维系软骨的结构和功能有极其重要的作用。Ⅱ型胶原是透明软骨基质的特异性标志。前两节我们已在实验观察部分对兔喉甲状软骨缺损修复区新生软骨和构建出的组织工程化喉软骨通过部分特殊染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学方法做了胶原组织的定性检测，证实再生软骨组织Ⅱ型胶原含量丰富。除了前述软骨组织胶原检测方法外，还有其他一些常用定性和定量检测的方法。
（一）软骨基质胶原Mallory三色染色法（MCT法）
【组织固定】 10%中性甲醛、70%～90%乙醇和Zenker液等均可。
【试剂配制】
（1）Mallory液：苯胺蓝0．5g、橘黄G 2g、磷钨酸1g、蒸馏水100ml。
（2）酸性复红液：酸性复红0．5g、蒸馏水100ml。
【染色方法】
（1）4～5μm石蜡切片，二甲苯脱蜡、过逐级乙醇至蒸馏水；
（2）软骨组织若用Zenker液固定，应先用0．5%碘酒溶液脱汞5～10min，水洗后再用0．5%硫代硫酸钠水溶液脱碘；
（3）Harris明矾苏木精染液染2～3min；
（4）水洗后，0．5%盐酸乙醇分化，蒸馏水洗2遍；
（5）入酸性复红水溶液2～5min；
（6）入Mallory液20～40min；
（7）逐级乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
【染色结果】 软骨组织中胶原组织染呈深蓝色。
（二）软骨基质胶原偶氮卡红苯胺蓝染色法（Azocarmin and aniline blue，Azan法）
【组织固定】 Zenker液、Bouin液和Carnoy液等均可，小块组织固定时间以12～24h为佳。
【试剂配制】
（1）偶氮卡红液：偶氮卡红1g，加入100ml蒸馏水中，煮沸溶解，冷却后慢慢滴入冰醋酸1ml，过滤后备用。
（2）苯胺蓝橘黄液：苯胺蓝0．5g、橘黄G 2g、蒸馏水100ml，煮沸溶解，冷却后过滤，再加入冰醋酸8ml，染色前稀释1～3倍。
（3）苯胺乙醇液：苯胺0．1～1g、95%乙醇100ml。
【染色方法】
（1）4～5μm石蜡切片，二甲苯脱蜡、过逐级乙醇至蒸馏水；
（2）偶氮卡红液染30～60min，蒸馏水洗；
（3）苯胺乙醇液分化至细胞核鲜红，胞质褪色为止；
（4）入含1%冰醋酸的95%乙醇中1～2min，以洗去苯胺；
（5）入5%磷钨酸水溶液1～3h，蒸馏水漂洗；
（6）苯胺蓝橘黄液染1～3h，蒸馏水漂洗；
（7）逐级乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
【染色结果】 软骨基质胶原呈蓝色。
（三）软骨基质胶原的定量测定
透明软骨基质Ⅱ型胶原中含有特异的氨基酸－羟脯氨酸（hydroxyproline，HPR），它含量稳定，通过测定HPR的含量可以基本了解软骨中胶原的含量。
【测定原理】 HPR在有过量丙氨酸存在下，用氯胺T氧化可生成Δ′－吡咯啉－4－羟－2羧酸，加热后使其溶于甲苯，与对二甲氨基苯甲醛反应，显色后可于540nm波长进行比色定量。本法对羟脯氨酸专属性强，其他氨基酸即使同时存在1万倍量也不干扰。
【测定方法】
（1）软骨脱脂：将软骨切成薄片，置20ml试管中，加丙酮2次，各6h弃去，样品放入乙醚中过夜，得到脱脂软骨组织片，剪切软骨呈1mm×1mm左右碎块，置50℃恒温箱中干燥。
（2）胶原提取：干燥的脱脂软骨样品，每份称取50mg，置10ml带盖试管中，加入0．3mol／L三氯醋酸（TCA）3ml，置90℃恒温箱内3h，冷却后3 000r／min离心5～8min，取上清，沉淀依上法提取一次，合并上清后，将盛有提取液的试管置烘箱中蒸干备测。
（3）待测样品制备：蒸干后的试管中加入6mol／L HCl 2ml，溶解全部样品后移入5ml洁净试管内，密封管口，120℃水解10h。取水解液20μl，加蒸馏水6ml，摇匀，待测。
（4）标准测试液配制：取2mg标准HPR，溶于50ml容量瓶中，配成储备液，测试时按0、2、4、6、8……16μg／ml稀释成不同浓度梯度，与待测样品同步测试。
（5）HPR测定：取待测样品1ml，加入0．05mol／L CuSO40．5ml及10%NaOH 0．5ml，再加入6%H2O20．5ml，置30℃水浴10min，其间振荡3次；加入无水乙醇0．5ml，放置20min，并振荡至少3次；加6mol／L HCl 1ml，再加5%对二甲氨基苯甲醛1ml，摇匀，于60℃水浴15min，自然冷却后，用分光光度仪测540nm吸光值。
（6）胶原含量计算：样品HPR含量＝标准HPR含量×所测样品吸光值／标准HPR此含量吸光值。
样品中胶原含量百分比（1ml水解物）＝样品HPR含量／组织量×D×100（D为计算常数，D＝7．46）。
【HPR鉴别】 取检测液点于层析滤纸上，干燥后点吲哚醌溶液（1g吲哚醌溶于100ml乙酸及10ml冰醋酸），热风吹干，则HPR显墨绿色，（与其他氨基酸显色有别，如脯氨酸显深蓝色，其他氨基酸显不同的紫红色），再点上对二甲氨基苯甲醛溶液［1g对二甲氨基苯甲醛溶于100ml丙酮浓盐酸（9∶1）混合液中，新配制］，吹干，HPR检测点即转为玫瑰红色，其他氨基酸与吲哚醌所产生的颜色即褪去。
二、软骨基质酸性黏多糖检测
黏多糖是软骨基质的另一重要成分，其含量直接代表了软骨基质中特异性大分子聚糖体的含量。对其定性、定量检测有助于对构建出的组织工程化喉软骨质量的了解。软骨基质黏多糖以酸性黏多糖为主，其间也含有少量中性黏多糖，对其定性定量检测，除前述AB－PAS方法外，还有下列一些常用方法。
（一）软骨基质黏多糖Lev－Spicer染色法
【组织固定】 10%甲醛或4%多聚甲醛、Carnoy液等。
【试剂配制】 阿尔辛蓝（pH1．0）染液：阿尔辛蓝8GS 1g、0．1N盐酸水溶液100ml。
【染色方法】
（1）4～5μm石蜡切片，二甲苯脱蜡、过逐级乙醇至蒸馏水；
（2）阿尔辛蓝染液染20～40min；
（3）0．1N盐酸水溶液稍洗；
（4）不经水洗，用滤纸吸去多余盐酸；
（5）逐级乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
【染色结果】 软骨基质黏多糖染呈蓝色。
（二）软骨基质黏多糖甲苯胺蓝（toluidine blue）－PAS染色法
【组织固定】10%甲醛或4%多聚甲醛、Carnoy液等。
【试剂配制】
（1）甲苯胺蓝Schiff液：甲苯胺蓝1g、1M盐酸20ml、重亚硫酸钠2g、蒸馏水200ml。先将200ml蒸馏水煮沸，然后加入甲苯胺蓝，再煮沸1min，冷却至50℃时加入盐酸，摇均后再加入重亚硫酸钠，贮存待用。
（2）氢氧化钾液：氢氧化钾0．5g、70%乙醇100ml。
【染色方法】
（1）石蜡切片二甲苯脱蜡、过逐级乙醇至蒸馏水，用1%过碘酸氧化20min；
（2）蒸馏水充分洗后用甲苯胺蓝Schiff液染15min；
（3）水洗5min，再用70%乙醇浸洗，然后将切片置于氢氧化钾液中30min；
（4）70%乙醇洗后用蒸馏水洗3遍；
（5）用Schiff原液染10min，自来水冲洗5min；
（6）逐级乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
【染色结果】 软骨基质黏多糖呈蓝色。
（三）软骨基质酸性黏多糖蛋白酶消化法定量检测
【检测原理】 软骨基质中的酸性黏多糖是以蛋白多糖的形式存在的，一种蛋白质往往含有数十条或上百条黏多糖链，蛋白多糖单体分子常与其他蛋白多糖分子或蛋白质分子形成聚集体。已知蛋白多糖中链与核心蛋白通过共价键连接（糖肽链）。其联结点是在木糖和丝氨酸羟基之间有一个糖苷键。蛋白多糖的聚集体则通过次级键（氢键、盐键等）形成。因而提取分离黏多糖仅仅依靠破坏次级键的作用只能分离蛋白多糖，而必须以降解蛋白质的方法，破坏多糖链与蛋白质的共价结合，方能达到提取黏多糖的目的。
近年来提取软骨基质中的黏多糖常用蛋白质水解酶消化法，利用专一性低的蛋白水解酶进行广泛水解当然最为理想。但由于蛋白酶不能断裂糖肽链及其附近的肽键，因此生成物可能保留较长的肽段。为除去肽段，以不改变糖链结构为前提，可和碱合用。
常用的蛋白水解酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和链霉菌蛋白酶，其中以木瓜蛋白酶和链霉菌蛋白酶最为常用。
【检测方法】
（1）软骨脱脂：取新鲜软骨组织，去净附着的软组织和软骨膜，切成薄片，剪成1mm× 1mm×1mm左右碎块，用5倍体积丙酮处理两次，乙醚处理1次，以脱水和去脂，组织块真空干燥。
（2）酶消化：将干燥脱脂软骨，加入10倍体积0．1mol／L磷酸盐缓冲液（pH8．0），加入胰蛋白酶（终浓度达0．25%左右），混匀后加入少量甲苯，37℃消化，直到组织完全化解为止，此时软骨被消化成黏粥状。用醋酸调整软骨消化悬液pH至6．0，加入EDTA及半胱氨酸盐酸盐（使两者终浓度分别为0．005mol／L），然后再加入木瓜蛋白酶溶液（2mg／g干燥组织），混匀后置60℃水浴中消化36h左右，并随时用0．1M氢氧化钠调整pH，当消化液由稀粥状变为透明状时，表示消化完毕。
（3）酸性黏多糖获取：将消化液在低温离心机中离心（3 000r／min），取上清液，加入40%三氯醋酸至不再出现沉淀为止，离心后取上清液，将上清液对水透析，将透析液浓缩至原体积一半，然后滴加2%氯化二六烷基吡啶溶液至不再出现沉淀为止，过滤、收集沉淀，沉淀物用少量0．6mol／L氯化钠液洗3次，洗液弃去。将沉淀溶于少量1．2mol／L氯化钠溶液中，加入3倍体积2%醋酸钠乙醇液，硫酸黏多糖（主要为硫酸软骨素成分）即沉出，翌日离心，沉淀用少量乙醇洗涤3次后，真空干燥，即得所测软骨基质酸性黏多糖干燥品。
（四）图像分析技术在软骨基质酸性黏多糖定量检测中的应用
根据软骨基质特殊染色深浅与软骨基质黏多糖含量成正比的关系，用特制的图像分析扫描仪将标本染色图像输入计算机，计算机通过一定的图像分析软件根据标本染色的深浅进行细致的分析，得出其灰度值，依图像分析灰度值可求得软骨基质胶原或黏多糖的大致含量。图像分析系统定量法测定软骨基质胶原或黏多糖含量要求所有待测标本在取材、切片、染色及所用图像分析条件上严格保持一致，每一染色标本随机抽取用于图像分析的片数不应少于5片，计算不少于5片图像分析结果的平均值作为其含量参考值。
三、软骨组织生物力学检测
1．软骨力学性质 软骨组织结构相对简单，仅由软骨细胞及其分泌的基质成分组成，不含无机盐，所以在质地上相对柔软，有一定的形变范围，在一定程度上能承受压缩、弯曲和剪切载荷。一般情况下软骨在自重或一定的力学载荷下能维持本身及其所构成器官的几何形态，具有支持、连结与缓冲功能。目前，软骨组织的生物力学在关节软骨研究得较多，包括它的黏弹性、应力－应变性、表面润滑和磨损性等都有研究的报道。但在耳鼻咽喉科领域有关软骨组织的生物力学研究颇少。迄今，耳鼻咽喉软骨组织生物力学的测试指标、测试方法和有代表性的力学数据尚没有确立。根据喉支架软骨部位、形态和解剖结构特点，并与其生理功能相结合，一般认为喉支架软骨的生物力学应注重其拉伸、压缩和支撑力及其影响因素的研究上。组织工程化喉支架软骨的生物力学测试应在可比范围内与相应的自然状态喉支架软骨生物力学测试数据相比，以确定构建出的人工喉软骨生物力学性能和实际应用的可行性。
研究组织工程化喉支架软骨生物力学，首先应了解软骨的黏弹性概念。软骨的弹性是指软骨在变形后恢复到变形前的形状和尺寸的能力。黏性则是指加载时阻滞物体变形和卸载时阻滞物体恢复原有形状和尺寸的能力。软骨黏弹性特点主要表现在以下几个方面：①力－变形的滞后性；②应力松弛特性；③蠕变特性；④变形速率影响特性等。
力－变形滞后性表现为在软骨的加载和卸载循环中其曲线不重合，反映出在顺序作用力下软骨加载和卸载后的变形与所需能量是不相同的。
应力松弛特性可用软骨的松弛曲线来描述，即将软骨由原有长度L1迅速拉伸到长度L2，并且使它张紧在L2长度上，此时软骨中出现了张紧力T0，随着时间的延长此张紧力越来越小，将每一时刻的张紧力T与T0之比作为时间的函数作出的曲线即为松弛曲线，用公式表示为：
式中t为时间，C、τ1、τ2为材料常数，E是时间的函数，可以由Abramowitz（1964）专用表给出，当t→∞时，由该表得出的E值为零。
软骨的松弛特性反映出在压力载荷作用下，其瞬间松弛速度极快，以便在较短的时间内吸收较多的能量，以减少冲击载荷伤害的持续性。
蠕变特性表现在当软骨受到恒定不变的载荷时，其变形将不断加大，但最后会趋于一恒定值。
变形速率影响特性表现为软骨在不同的变形速度（一般以mm／s计）时，其所需的作用力明显不同。
软骨结构决定了软骨的黏弹性，黏弹性影响着软骨的生物力学性质。
2．软骨生物力学主要测试指标
（1）力：是物体之间的相互作用，它能使物体的运动状态发生变化或使物体发生形变。单位：牛顿（N）。
（2）应变：物体受力作用时发生形变，其体积、形态和长度变化与其原有值之比。
（3）应力：是物体中各部分之间单位面积上相互作用的内力。
（4）刚度：物体产生单位变形所需的外力，材料的弹性模量和剪切模量越大，则刚度越大。
3．软骨生物力学测试手段
（1）材料力学试验机测量：可以直接测出位移、力和应变等力学指标。推荐美国MTS公司20世纪90年代推出的生物材料力学测试机（MTS－858型），它由计算机自动控制，液压伺服，双轴双向（上下拉压，左右扭转），既能位移控制，又能载荷控制，可载范围及速度可调范围广。国内长春试验机研究所20世纪80年代后期制造的万能材料试验机（SWD－10型）也是较好的材料力学试验机，它操作简单，使用方便，是单轴单拉、单压位移控制试验机。其传感器精确度高，通过计算机进行数据采集，可以直接测量力、位移、应变等生物力学指标，通过转换装置，还可进行力矩和角位移的测量。
（2）撞击试验机测量：可模拟战伤、交通事故伤和其他创伤等对撞击速度和能量的要求，测量不同模拟状态下的软骨生物力学指标。推荐第一军医大学全军重点生物力学实验室自行设计制造的CZZ－Ⅱ型撞击试验机。
（3）三维运动试验机测量：通过对软骨标本反复进行加载、卸载，可测量软骨的屈、伸、左右侧弯和左右旋转等运动幅度，从而确定软骨的三维运动范围。第一军医大学全军重点生物力学实验室自行设计制造的三维运动试验机可满足对软骨的三维运动的测量。
（4）压敏片测量法：是目前较先进的医用生物力学测试方法，其基本原理是应用特制的试纸样压敏片感受测试物所受的作用力，压敏片能根据受力的大小呈现出不同深浅度的颜色。测试后的压敏片用图像扫描仪将所测不同深浅度的颜色输入计算机，通过事先编好的程序将压敏片不同深浅度的颜色转化成大小不同的力值，从而得到所测软骨的生物力学数据。
四、组织工程化喉软骨的电子显微镜观察
（一）透射电子显微镜观察
1．标本处理
（1）取材：透射电子显微镜观察软骨超微结构须先将标本做成厚度为10～100nm的超薄切片，由于透射电镜观察视野小，所以取材正确与否直接关系到电镜观察的准确性与效果。正确的取材必须做到：①组织切取必须快速，一般要求在1～2min内把要观察的组织浸入固定液；②切取的组织块要尽可能小，一般以0．5～1．0mm3大小为宜，以利于固定液的渗透；③所用固定液要预冷，以降低离体细胞内酶的活性，减少细胞自溶；④所用切割器要锋利干净，一刀切成，避免锯、扯、压等不良操作和其他杂质污染，以防细胞受到损伤与影响结果的准确性。
（2）固定：用于透射电镜观察的软骨组织，其主要固定方法是化学固定法，最常用的固定方式是浸泡固定。固定液包括1%～2%四氧化锇（osmium tetroxide）、1%～4%戊二醛（glutaraldehyde）、4%多聚甲醛（paraformaldehyde）或戊二醛与多聚甲醛的混合液等。
（3）脱水：一般用乙醇或丙酮作为脱水剂，其程序为：30%乙醇或丙酮5～10min；50%乙醇或丙酮5～10min；70%乙醇或丙酮5～10min；90%乙醇或丙酮10～20min；100%乙醇或丙酮脱水3次，10～15min／次。
（4）渗透与包埋：一般所用渗透与包埋剂为环氧树脂类物质，包括Epon812、ERL－4206（也称Spurr树脂）、TAAB812、环氧树脂600和环氧树脂618等。渗透与包埋分三步走：①将样品置于100%脱水剂及等量包埋剂的混合液中，室温下至少30min或数小时；②将样品置于纯包埋剂中，室温下数小时或过夜；③将样品置于一定的空心模具内，灌满包埋剂，然后根据包埋剂聚合时所需的时间和温度置温箱内聚合，制成包埋块。
（5）切片：用装有钻石刀的超薄切片机将软骨组织切成50nm左右的超薄切片，特制铜网捞取超薄切片，滤纸吸干。
（6）染色：一般用醋酸铀和柠檬酸铅双重染色。切片经双重染色后，即可在电镜下观察。
2．标本观察 软骨组织透射电子显微镜观察包括软骨细胞和基质两大部分。细胞部分的观察应注意细胞膜、内质网、高尔基复合体、线粒体、溶酶体、核膜以及胞质中的包含物如脂滴、糖原和结晶状蛋白质等，除此之外，还应注意其中心体、微管、微丝、核仁、染色体和核蛋白体等；基质部分的观察应注意胶原纤维排列和蛋白多糖大分子的结构。组织工程化软骨的电子显微镜下观察应与正常软骨组织作比较，以确定其超微结构表现。
（二）扫描电子显微镜观察
扫描电子显微镜主要是观察组织或细胞表面的超微形貌，在组织工程化喉软骨构建过程中主要用于种子细胞生长环节及其与生物材料复合情况的观察。
1．样品处理 主要包括取材、清洁、固定、脱水、干燥、黏托和镀膜等操作。
（1）取材：生长在一定支持物上的细胞可以直接从培养环境中取出做清洁处理，无支持物的细胞分离后可适当离心使其成为细胞团，然后进行清洁处理或直接固定，负载了软骨细胞的生物材料自培养环境中取出后，根据情况做清洁处理或直接固定。
（2）清洁：一般用PBS、蒸馏水或生理盐水等溶液进行适当漂洗。
（3）固定：冷丙酮、无水乙醇、戊二醛和多聚甲醛等均可以作为软骨细胞的固定剂。固定后PBS漂洗3次，2～3min／次。
（4）脱水：逐级乙醇脱水。
（5）干燥：自然干燥或用临界点干燥法使标本干燥。
（6）黏托与镀膜：有支持物的细胞可以直接离子浅射喷金镀膜；无支持物的样品须用一定的导电胶将样品胶粘在装物台上，然后浅射喷金镀膜。
2．样品观察 喷金镀膜后的样品即可进行扫描电镜观察，对软骨种子细胞及其与生物材料的复合应注意观察细胞的形态、表面形貌、细胞与细胞间的关系以及细胞在生物材料上的分布、黏附和分泌等情况。
（南方医科大学附属南方医院 孙安科）
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