生化分析仪的参数设置与校准

(一)生化分析仪的参数设置

对生化分析仪的参数进行恰当的设置是用好生化分析仪最重要的部分之一,也是操作者能否正确控制仪器完成一系列复杂而有序操作程序的关键,可参考仪器及试剂盒给出的方法和参数进行设置。一般分为必选分析参数和备选分析参数。

1.必选分析参数 是分析仪检测的前提条件,没有这些参数无法进行检测。

(1)试验名称:也称通道名称,指测定项目的标示符,常以项目的英文缩写表示。

(2)分析方法:有终点法、两点法、连续监测法等,根据被检物质的检测方法原理,选择其中一种反应类型。

(3)反应温度:自动生化分析仪通过温度控制系统保持温度恒定,以保证反应的正常进行。一般有25℃、30℃、37℃可供选择,根据试剂盒说明书进行设置,通常为37℃。

(4)波长:波长的正确选择有利于提高反应的灵敏度和准确度,有单波长和双波长之分,有的甚至有三波长或多波长。双波长中有主波长和次波长。主波长是指与被测物质反应产物的光吸收有关的波长,次波长是与主波长、干扰物质光吸收有关的波长,主要用于消除脂血、溶血、黄疸的干扰。次波长是根据测定波长选择的辅助波长,要求干扰物质在测定波长与辅助波长有相同的吸光度。

(5)反应方向:有正向和负向反应两种,吸光度增加为正向反应,反之为负向反应。

(6)标本和试剂量:标本和试剂量的设置要根据试剂说明书和仪器的特性进行。仪器的特性包括:标本和试剂的最小加样量及加量范围、最小反应液的体积等。一般推荐标本与试剂的体积比为1∶10。实际工作中为节约成本可根据比例缩小标本和试剂用量,但必须满足最小反应液总量。标本量可设置常量、减量和增量。减量和增量一般设定为常量的一倍。

(7)反应总量:在不同的分析仪有不同的规定范围,一般是180~350μl,个别仪器能减少至120μl。反应总量太少无法进行吸光度测定。

(8)孵育时间:终点法或两点法用。终点法是标本与试剂混匀开始至反应终点为止的时间;两点法是第一个吸光度选择点开始至第二个吸光度选择点为止的时间。

(9)延迟时间:连续监测法或两点法用。延迟时间在连续监测法中标本与反应试剂(第二试剂)混匀开始至连续监测期第一个吸光度选择点之间的时间。在酶促反应开始的阶段,由于各因素的影响,酶促反应速率较慢,可以是几秒到几分钟,尤其是双底物反应或需要辅酶参与者,通常为1~3min。一般单试剂法只需30s,常用项目中丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、肌酸激酶需要特别注意。

(10)连续监测时间:酶促反应延滞期后,在过量底物存在时,反应速率加快并达到反应速率稳定的阶段,即酶促反应以恒定的速率进行,不受底物浓度的影响,这段时间称为线性反应期或零级反应期,自动化生化分析仪的监测时间即为此期。该时间在延迟时间之后即开始,一般为60~120s,不少于4个点(3个吸光度变化值)。监测时间过长容易发生底物耗尽,可测范围变窄。

(11)分析时间:包括孵育时间、延迟时间、监测时间等,不同的分析方法应选择相应的分析时间。

(12)线性范围:检测物浓度与检测信号大小成比例的范围。按试剂质量设置,超过此范围应增加标本量或减少标本量重测。不同的试剂质量不同,不同标本试剂比的线性范围也不一样,因此,检测人员应实测试剂盒的线性范围。

(13)计算因子F值(或系数K):连续监测法用。F值对于酶的测定十分重要,过高线性较宽,但重复性差;太窄则精密度好,但检测线性窄。因此,要根据实际情况合理设置和应用。F值的设置应参考酶参考值的上限及测定时间,以保证测定结果可靠。计算方法如下。

①理论F值的计算。连续监测法测定酶活性时,不需作标准管或标准曲线,根据摩尔吸光系数很容易进行酶活性的计算。先测定线性范围内每分钟吸光度的变化(ΔA/min),以U/ L代表酶活性时,可按下式进行计算:U/L=ΔA/min×V×106/(ε×v×L)。

式中:V为反应体系体积(ml);ε为摩尔吸光系数(cm2/mol);v为标本量(ml);L为比色杯光径(cm);ΔA为吸光度变化;106为将mol换算成μmol。条件固定时,从理论上V、v和L为固定值,ε为常数,则上式简化为U/L=ΔA/min×F,F=V×106/(ε×v×L)。

②实际F值。在实际工作中,仪器诸多因素如波长的准确性、半波宽的大小、比色杯光径及磨损与清洁度、温控的准确性、加样系统状况等都会影响ε值或上式中的相关项。因此,应在具体条件下,定期检查和实际测定ε和系数F值(即仪器的实测F值)。

如NAD(P)H的ε值因NAD(P)H不稳定,可用葡萄糖己糖激酶法实测。将某一浓度的葡萄糖溶液,重复测定5~10次,得相应吸光度,求A±s,s必须低于仪器规定的批内允许值。根据ε=A/(C×L)×V/v求出NAD(P)H的实际ε值。式中C为标准液浓度(mol/L);L为比色杯光径(cm);V为反应总体积(ml);v为标本体积(ml)。再根据F=V×106/(ε×v×L),得到实际F值=C×106/A。

此外,一些色素源指示物在不同的介质环境,其ε会发生不同程度的变化。对可产生高纯且稳定的物质如对硝基苯酚、对硝基苯胺和5-硫代-2-硝基苯甲酸等,可将其配置在一定的介质中,直接在实际仪器条件下测定吸光度,求实测ε及实测F值。

2.备选分析参数 这类分析参数与检测结果的准确性有关,一般不设置这类分析参数也能检测出结果,但标本中待测物浓度太高等,检测结果可能不准确。

(1)稀释标本:稀释设置标本量、稀释剂量和稀释后标本量三个数值,可在分析前自动对标本进行高倍稀释。

(2)底物耗尽值:连续监测法或两点法用。底物耗尽值在负反应的酶活性测定中设置,以规定吸光度下降限。若低于此限则底物太少,结果不可靠,标本应稀释5~10倍重测。

(3)前区检查:免疫比浊法用,以判断是否有抗原过剩。比较免疫比浊分析过程中后两个读数点的差别,如果后一点的吸光度比前一点低,表示有抗原过剩,应稀释标本后重测。

(4)试剂空白吸光度范围:如超过设定范围,表示试剂已变质,应更换合格试剂。

(5)试剂空白速率:连续监测法用。是试剂本身在监测过程中底物自动降解得到的速率,可在标本测定结果中自动扣除。测定方法为选择试剂速率程序,用该项目的参数,以水代替标本,测得结果储存于仪器中,测得的标本结果能自动扣除试剂空白速率的数值。

(6)线性度:连续监测法用。是非线性比率的界线,常用%表示。线性度大,说明ΔA之间已不成线性,超过限额说明底物不足,检测结果偏低,应稀释后重测。

此外还有校准参数、线性回归方程、小数点位数、计量单位、正常参考值等分析参数,均可按照实际情况进行设置。

(二)检测系统及量值溯源

测定结果的溯源性是指测定结果的可追溯性,通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链,使测量结果或测量标准的值能够与规定的参考标准发生联系,通常是与国家标准或国际标准联系起来的特性。溯源性的目标是改进超空间和时间上试验结果的可比性。

欲使医学实验室的测量结果具有溯源性,最直接、简便的途径是进入“不间断的比较链”,即溯源链。使用具有“物质互换链”的校正物,只有当用常规校正物校准仪器后,使用常规方法测定的标本结果x与用参考方法测定的结果y之间不存在统计学上的显著差异才能表明结果具溯源性。据此推荐使用检测系统,这是一个好的途径。

1.检测系统与量值溯源 完成一个项目检验所涉及的仪器、试剂、校准品、操作程序、质量控制、保养计划(手工操作必须包括具体操作人员)等的组合称为检测系统。世界上有许多检测系统,例如Beckman、Abott、Olympus、Sysmex等生产商,他们都有各自制造的仪器和与其配套使用的试剂、校准品、操作程序、质量控制和保养计划组成的检测系统。像Beckman和Roche公司,他们甚至都有自己的主校正物和常规校正物,并得到管理部门的批准。医学实验室选用这样的检测系统,并进行定期校准写成文件就认为进入了溯源链,这样的结果就具有了溯源性。

2.量值溯源的模式 量值溯源可以提高检测结果的准确性,提高不同实验室检测结果的可比性,是提高检验质量的重要手段,检验结果的溯源性将可能成为临床实验室的检验工作和检验试剂生产的重要质量指标。

临床检验的量值溯源可有不同模式,但中心内容是使各测量方法的测量值与一公认的标准发生联系。图3-5为ISO 17511描述的溯源图。一个标本或参考物质测量结果的溯源性通过一系列的对比测量建立,对比测量中的测量过程和校准物质的计量学等级由低到高组成一条连续的链(溯源链)。链的顶端是国际单位制(SI)单位(基本或导出单位),SI单位国际通用,不随时间和空间的变化而变化,因此它们是溯源链的最高等级。溯源链自上而下各环节的溯源性逐渐降低,而不确定度则逐渐增加,因此量值溯源过程应尽量减少中间环节。从计量学角度上讲,理想的情况是用一级参考测量过程直接测量标本,省去所有中间环节,这在临床检验中显然是不可能的。

图3-5　ISO 17511量值溯源

(三)生化分析仪的校准

生化分析的校准是检验实验室必不可少的一项工作,对于保证实验室检验结果的准确性和可靠性是非常重要的。校准可以分两方面,一方面是仪器校准,另一方面是检验项目校准。仪器校准包括生化分析仪常用的波长、温度,加样量、基线,检测限的稳定性;检验项目校准通常指临床实验室常规进行工作的内容,即每测定一个项目都要进行校准。

1.校准方法

(1)单点定标:只有一个浓度点,那么一个浓度点从道理上讲是不能决定曲线的,所以它是默认通过零点,这条曲线就是一种校准物质的方法。

(2)两点定标:若校准曲线呈直线但不通过原点,则需用两个浓度的校准液做两点校准。

(3)多点定标:当校准曲线不呈直线而为真正的曲线时,应做多点校准。

(4)F值:F值分为理论F值和实际F值,理论F值就是根据光镜、反应体积,加样量等算出来的。但实际应用过程中也会有偏差,每台仪器也有一定的偏差,所以应该通过实验进行校准,使用实际F值。校准方法前述。

2.对校准的要求

(1)准品的选择:原装配套检测系统用厂家提供的校准品校准,自建检测系统可选择不同的标准品校准,但必须具有溯源性。无论何种检测系统都不能用质控血清代替校准品。

(2)校准频度的确定:根据检测项目方法和试剂的稳定性不同确定不同的校准频度,如每日校准、每周校准、每月校准、每两月校准等,至少每6个月进行1次校准。

(3)如有下列情况发生,必须进行校准:①更换试剂批号,如果实验室能说明改变试剂批号并不影响结果的范围,可以不进行校准;②重要仪器部件的保养维护和更换;③质控结果失控及其他纠正措施无效。