血浆三酰甘油测定

TAG是由1分子甘油和3分子脂肪酸组成的一种中性脂类,主要存在于CM和VLDL中,其测定方法分为化学法和酶法两类。化学测定法代表性的方法有二氯甲烷-硅酸-变色酸法和乙酰丙酮显色法。TAG测定目前尚无公认的参考方法,美国疾病预防与控制中心(CDC)采用二氯甲烷-硅酸-变色酸法作为测定TAG的内部参考方法。乙酰丙酮显色法曾是测定血浆TAG的常规方法,但因操作繁杂、不能用于自动化分析等,已逐渐退出临床实验室。酶法始于20世纪70年代初,目前国内普遍采用磷酸甘油氧化酶法。

【原理】 血浆中TAG经脂蛋白酯酶(LPL)作用,水解为甘油和游离脂肪酸;甘油在ATP和甘油激酶(glycerokinase,GK)作用下,生成3-磷酸甘油,再经磷酸甘油氧化酶(glycerophosphate oxidase,GPO)作用,氧化生成磷酸二羟丙酮和H 2 O2;H 2 O2与4-氨基安替比林(4-AAP)及4-氯酚在过氧化物酶作用下,生成红色醌类化合物,其显色程度与TAG的浓度成正比。反应式如下。

【器材与试剂】

1.器材 恒温水浴箱、分光光度计、微量加样器、试管、刻度吸管。

2.试剂 不同厂家的试剂在组成上有些差别,具体含量见试剂盒说明书或相关文献。

(1)三酰甘油液体稳定酶试剂。

GOOD缓冲液(p H7.2) 50mmol/L

脂蛋白脂酶 ≥4000U/L

甘油激酶 ≥40U/L

磷酸甘油氧化酶 ≥2000U/L

过氧化物酶 ≥2000U/L

ATP 2.0mmol/L

硫酸镁 15mmol/L

4-AAP 0.4mmol/L

4-氯酚 4.0mmol/L

(2)三酰甘油标准液2.26mmol/L(200mg/dl):准确称取200 mg三油酸甘油酯(平均分子量:885.4),加5ml Triton X-100,用蒸馏水定容至100ml,分装后,4℃保存。

【操作】 取试管3支,按表7-6操作。

表7-6　GPO法测定TAG操作步骤

混匀后,37℃水浴5 min,用分光光度计比色,于500 nm波长,以空白管调零,分别读出各管吸光度值。

【计算】 血浆TAG(mmol/L)=标准液浓度

【参考区间】 成年人血浆TAG为0.45~1.69mmol/L。我国血脂异常防治建议以≤1.70mmol/L为合适水平,1.70~2.25mmol/L为临界范围(或边缘升高),≥2.26mmol/L为升高。

【质量保证】

1.血浆TAG易受饮食的影响。在进食脂肪后,2~4h内即可出现血浆浑浊,8h以后接近空腹水平。故要求空腹12h后采血,并要求72h内不饮酒,否则会使检测结果偏高。

2.检测标本可为血清,也可用以肝素或EDTA·2Na抗凝的血浆。

3.取血后应及时分离,以免红细胞膜磷脂在磷脂酶的作用下产生游离甘油,或者抗凝剂存在时红细胞内水溢出而稀释血浆降低TAG值。

4.若酶试剂变红色则不可再用,试剂空白吸光度应≤0.05。

5.本法的线性上限为11.4mmol/L,若所测TAG值超过11.0mmol/L,应将血浆用生理盐水稀释后重新测定,结果乘以稀释倍数。

6.血浆中游离甘油对TAG测定结果有一定影响。

7.LPL除水解三酰甘油外,也能水解单酰甘油和二酰甘油(这两者的血浆浓度约占三酰甘油的3%),故本法测定结果也包含后两者。酶反应的最后一步为Trinder反应,其影响因素与胆固醇酶测定法相同。高浓度的胆红素和维生素C可使测定结果偏低,两者含量正常对测定结果均无影响。

【应用评价】 本法具有简单、快速、微量且试剂稳定等优点,适用于手工和自动化测定。主要缺点是测定结果中包括血浆中游离甘油。要去除游离甘油,常用的校正方法有两种。

1.外空白法 同时加做一份不含LPL的酶试剂测定游离甘油作为空白值。此法需做双份测定,使成本加倍,但可同时得到血浆游离甘油的数据。

2.内空白法 又称两步法或双试剂法。将酶试剂分成两部分,其中LPL和4-AAP组成试剂Ⅱ,其余部分为试剂Ⅰ,血浆先加试剂Ⅰ,37℃孵育后,因无LPL存在,TAG不被水解,游离甘油在甘油激酶和磷酸甘油氧化酶的作用下生成H 2 O2,但因不含4-AAP,不能完成显色反应,故可除去游离甘油的干扰;再加入试剂Ⅱ,即可测出TAG水解生成的甘油。内空白法增加了操作步骤,但不增加试剂成本,而且排除游离甘油的干扰,效果好。

中华医学会检验分会建议磷酸甘油氧化酶法作为临床实验室测定血浆TAG的常规方法。一般临床实验室可采用一步法,有条件的应考虑开展游离甘油测定或采用两步酶法。

【临床意义】 血浆TAG是临床血脂常规测定的重要指标,高TAG是冠心病的危险因素。

1.病理性TAG升高常见,多见于原发性或继发性高三酰甘油血症,如家族性高三酰甘油血症、家族性混合型高脂血症、冠心病、动脉粥样硬化、糖尿病、肾病综合征、甲状腺功能减退、胆道梗死、糖原贮积症、口服避孕药、酗酒等。值得注意的是,继发性或遗传性因素均可使血浆TAG升高,但主要见于代谢综合征。妊娠中、后期可见生理性升高。

2.TAG降低较少见,如慢性阻塞性肺疾病、脑梗死、甲状腺功能亢进、营养不良和消化吸收不良等。