血清胆红素测定

血清总胆红素及其组分的测定分为重氮盐法、胆红素氧化酶法(BOD)、高效液相色谱法(HPLC)、导数分光光度法及直接分光光度法5种。本节介绍重氮试剂改良J-G法和胆红素氧化酶法。

(一)改良J-G法测定血清总胆红素和结合胆红素

【原理】 血清中结合胆红素可直接与重氮试剂反应,产生偶氮胆红素;非结合胆红素在加速剂咖啡因-苯甲酸钠-醋酸钠作用下,其分子内氢键破坏后才能与重氮试剂反应,也产生偶氮胆红素。本法重氮反应p H6.5,最后加入碱性酒石酸钠使红色偶氮胆红素转变成蓝色偶氮胆红素。在600nm波长比色,其吸光度与胆红素浓度成正比。

【器材与试剂】

1.器材 试管、试管架、加样器、恒温水浴箱、分光光度计、铅笔、坐标纸。

2.试剂

(1)咖啡因-苯甲酸钠试剂:无水醋酸钠56g,苯甲酸钠56g,EDTA-Na2 1g,溶于约700ml水中,再加入咖啡因37.5g,搅拌至完全溶解(加入咖啡因后不能加热溶解),再加水至1L。试剂可能有轻微浑浊,用定量滤纸过滤,室温保存。

(2)5g/L亚硝酸钠溶液:称取亚硝酸钠0.5g,溶于约70ml蒸馏水中,再加蒸馏水至100ml。每2周配1次。储存于4℃冰箱。

(3)5g/L对氨基苯磺酸溶液:对氨基苯磺酸5g溶于约800ml去离子水中,加浓盐酸15ml,待完全溶解后,再加去离子水至1000ml,室温保存。

(4)重氮试剂:临用前,取上述亚硝酸钠溶液0.5ml与对氨基苯磺酸溶液20ml混匀。

(5)5g/L叠氮钠溶液:叠氮钠0.5g,用去离子水溶解并稀释至100ml。

(6)碱性酒石酸钠溶液:氢氧化钠75.0g与酒石酸钾钠(Na KC4 H 4 O 6·4 H 2 O)320g溶于约700ml蒸馏水中,再加水至1L。如果浑浊,过滤,室温保存。

(7)胆红素标准液:

①目前一般用游离(非结合)胆红素配制标准液:此标准品须用含清蛋白的溶剂配制,用人血清代替,收集无溶血、无黄疸、清晰的血清作为混合血清稀释剂。混合血清稀释剂应符合下列要求:混合血清1.0ml,加入新鲜0.154mmol/L NaCl溶液24ml,混匀。在414nm波长,光径1.0cm,以0.154mmol/L NaCl溶液调零,其吸光度应<0.100,在460nm波长的吸光度应<0.040。

②配制标准液的胆红素须符合下列标准:纯胆红素的氯仿溶液,在25℃条件下,光径(1.000±0.001)cm,波长453nm,摩尔吸光系数应在60 700±1600范围内;改良J-G法偶氮胆红素的摩尔吸光系数应为74 380±866。

③胆红素标准储存液(1712μmol/L):称取符合要求的纯胆红素(相对分子量584 068) 10.0mg,加二甲亚砜1ml,用玻璃棒搅拌成混悬液。加入0.05mol/L碳酸钠溶液2ml,使胆红素完全溶解,移入100ml容量瓶,以稀释用血清洗涤数次后并入容量瓶中,缓慢加入0.1mol/L盐酸2ml,边加边摇(切勿用力摇动,以免产生气泡)。最后以稀释用血清定容。配制过程中应尽量避光,贮存容器用黑纸包裹,置4℃冰箱3d内有效,要求配制后尽快绘制矫正曲线。

【操作】

1.样品的测定 按表9-6进行操作。

表9-6　改良J-G法测定总胆红素和结合胆红素操作步骤

混匀后,对照管调零,600nm波长,读取各管吸光度,从矫正曲线上查出总胆红素和结合胆红素浓度。

2.胆红素矫正曲线的绘制 按表9-7稀释胆红素储存液。

表9-7　胆红素标准液的配制

将以上各管充分混匀(不可产生气泡),按照血清总胆红素方法进行操作。每一浓度做3个平行管。每一浓度分别做标准对照管,以各自的标准对照管调零,读取各标准管的吸光度。配制标准液用的试剂血清中尚含有少量胆红素,同样测定后有一吸光度值。每个标准管的吸光度值均应减去此吸光度,而后与相应胆红素浓度绘制矫正曲线。

【参考区间】 血清总胆红素:3.4~17.12μmol/L;血清结合胆红素:0~3.42μmol/L。

【质量保证】

1.胆红素对光敏感,标准液及标本应尽量避光保存。胆红素标准品需妥善保存,正确配制。

2.轻度溶血对本法无影响,严重溶血可使测定结果偏低。

3.叠氮钠能破坏重氮试剂,终止偶氮反应。因此用叠氮钠作防腐剂的质控血清,可引起偶氮反应不完全,甚至不呈色。

4.胆红素342μmol/L的标本可减少标本用量,或用0.154mmol/L NaCl溶液稀释血清后重新测定。

5.本法测定血清总胆红素,在10~37℃条件下不受温度的影响,呈色2h内非常稳定。

6.标本对照管的吸光度一般很接近,若遇标本量很少时,可不做标本对照管,参照其他标本对照管的吸光度。

【应用评价】 结合胆红素测定在临床上应用很广,但至今无候选参考方法。方法不同,反应时间不同,结果差异很大。时间短,非结合胆红素参与反应少,但结合胆红素反应也不完全;时间长,结合胆红素反应较完全,但一部分非结合胆红素也参与反应。本法为推荐的常规方法,线性范围较宽,浓度在342μmol/L以下有较好的准确度和精密度,高浓度时准确度和精密度降低。因此,建议浓度过高应减少标本用量测定。在重氮试剂方法中,改良J-G法有好的灵敏度,抗干扰能力较好。血红蛋白低于1.0g/L无干扰。缺点是不能自动化分析。

【临床意义】

1.血清总胆红素 ①黄疸及黄疸程度的鉴别:溶血性、肝细胞性及阻塞性黄疸引起血清胆红素依次升高。②肝细胞损害程度和预后的判断:胆红素明显升高反映有严重的肝细胞损害,但某些疾病如胆汁淤积型肝炎,尽管肝细胞受累较轻,血清胆红素可升高。③新生儿溶血症:血清胆红素有助于了解病情的严重程度。④再生障碍性贫血及多种继发性贫血(主要见于癌或慢性肾炎引起),血清总胆红素减少。

2.血清结合胆红素 结合胆红素与总胆红素的比值可用于鉴别黄疸类型。①比值< 0.2,见于溶血性黄疸,也见于阵发性睡眠性血红蛋白尿、恶性贫血、红细胞增多症等。②比值0.4~0.6,主要见于肝细胞性黄疸。③比值>0.6,主要见于阻塞性黄疸。

(二)胆红素氧化酶法测定血清总胆红素和结合胆红素

【原理】 胆红素呈黄色,在450 nm附近有最大吸收峰。胆红素氧化酶(bilirubin oxidase,BOD)催化胆红素氧化,其吸光度下降的程度与胆红素浓度成正比。在p H 8.0条件下,未结合胆红素与结合胆红素均被氧化,加入十二烷基磺酸钠和胆酸钠等阴离子表面活性剂可促进氧化,用于总胆红素测定;在p H4.5条件下,BOD催化胆红素单葡糖醛酸酯、胆红素二葡糖醛酸酯和大部分δ-胆红素氧化,而未结合胆红素不被氧化,测定其含量代表结合胆红素。用溶于人血清中的二牛磺酸胆红素(ditaurobilirubin,DTB)作标准品,检测450nm吸光度的下降值可反映结合胆红素的含量。

【器材与试剂】

1.器材 试管、试管架、加样器、恒温水浴箱、分光光度计。

2.试剂

(1)0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(p H8.2):取三羟甲基氨基甲烷1.211g、胆酸钠172.3mg和SDS(十二烷基磺酸钠)432.6mg,溶于约90ml去离子水,在室温用1mol/L盐酸调p H至8.2,再加蒸馏水至100ml,置冰箱保存。此缓冲液含4mmol/L胆酸钠和15mmol/L的SDS。

(2)BOD溶液:如系冻干品,按说明书复融后保存时间不宜过长。如是液体,置4℃可保存较长时间。BOD贮存溶液的酶活性一般在数千至2万U/L,BOD工作液酶活性按反应液中BOD终浓度达0.3~1.0U/ml计算。

(3)0.2mol/L磷酸盐缓冲液(p H4.5)。

(4)总胆红素标准液:342μmol/L。

(5)结合胆红素标准液:将DTB配于胆红素浓度可忽略不计的人血清中,或用冻干品按说明书要求配制。配制后分装于聚丙烯管内,-70℃保存,可稳定6个月。

【操作】

1.总胆红素测定 按表9-8进行操作。

表9-8　酶法测定总胆红素操作步骤

加入BOD工作液后立即混匀,各管置37℃水浴5min,用分光光度计450nm波长比色,以蒸馏水调零,分别读取各管吸光度。

2.结合胆红素测定 按表9-9进行操作。

表9-9　酶法测定结合胆红素操作步骤

立即混匀,置37℃水浴5min,用分光光度计450nm波长比色,以蒸馏水调零,分别读取各管吸光度。

【计算】

【参考区间】 同改良J-G法。

【质量保证】

1.BOD浓度的选择 BOD在反应液中的终浓度为0.18~1.14U/ml。BOD浓度的选择,可根据所用制品在测定高胆红素血清标本或342μmol/L标准液的反应速度(能否在5min反应完全而确定)。由于测定结合胆红素时反应液p H偏离BOD的最适范围,故要求BOD有较高的浓度。一般其终浓度不低于0.5U/ml。

2.浑浊问题 黄疸血清或肝素抗凝的血浆,在反应15min后,几乎均产生浑浊而影响结果。测定结合胆红素应选择p H为4.5,p H<4.0时,血清易浑浊,严重干扰测定结果。

【应用评价】 酶法测定胆红素,对血样和试剂的耗量少,特异性高,重复性好。不仅适合手工简便操作,也适合自动生化分析仪测定。测定总胆红素时,有更宽的线性范围(0~513 μmol/L)。高低浓度标本的精密度批内、批间CV变化不大,回收率在93%~102%,说明BOD法测定总胆红素的准确度、精密度比改良J-G法好。脂血和溶血均可使测定结果升高。结合胆红素的线性范围在0~342μmol/L内,批内CV在2.5%~2.8%。抗干扰能力强,血红蛋白<1.5g/L不产生干扰。

【临床意义】 见改良J-G法。