蛋白类标志物

血清心肌酶的测定对AMI的诊断有一定帮助,但仍存在许多不足,主要为:①酶活性升高出现较晚,对AMI的早期诊断受到一定的限制;②持续时间短,AMI发生3d后CK即可恢复正常;③特异性较差,其他组织的损伤也可导致心肌酶升高。近年来发展起来的蛋白类标志物,如心肌肌钙蛋白、肌红蛋白、CK-MB质量测定是目前认为较好的心肌损伤标志物,可用于诊断AMI、评价溶栓治疗的效果、判断再栓塞或栓塞范围及危险程度等,其临床价值明显优于心肌酶谱测定。

(一)心肌肌钙蛋白

1.概述 1987年Cummins等首先报道心肌肌钙蛋白(cardiac troponin,c Tn)用于诊断AMI。近年来的临床和实验研究发现,c Tn在心肌细胞损伤的早期,其血清浓度明显增加,敏感性和特异性很高,且持续时间长,可作为缺血性心脏疾病有价值的诊断指标。

存在于心肌细胞中的肌钙蛋白称为c Tn。不同种属的c Tn氨基酸序列有较高的同源性,其抗原性相同,因此c Tn种属特异性较低。在心肌肌钙蛋白的3种亚基(c TnC、c TnI、c Tn T)中,心肌肌钙蛋白C基因在心肌及骨骼肌中的转录产物是一样的,因此骨骼肌和心肌中的TnC是相同的,没有心肌特异性,c TnC不能作为心肌损伤的特异性标志物,不能用于心肌损伤的检查。心肌肌钙蛋白T(c Tn T)和心肌肌钙蛋白I(c TnI)在骨骼肌和心肌中的表达分别受不同的基因调控,由不同的基因编码,具有不同的氨基酸序列和相对分子质量,故c TnI和c Tn T是心肌细胞特有的蛋白质成分,且含量丰富,远高于CK-MB(每克心肌组织约含c Tn T 10.8mg、c TnI 5.0mg,而CK-MB仅1.4mg),其敏感度高于CK,不仅能检测出AMI,而且能检测微小损伤。和CK-MB比较,正常人血清中几乎测不到c Tn,因而它对AMI有较高的分辨能力。c Tn窗口期长,c Tn T长达7d,c TnI长达10d,甚至14d。c Tn半衰期较长,主要是局部坏死肌纤维不断释放c Tn,在诊断发现较迟的AMI可替代LDH。怀疑AMI,一般在入院、入院后6h、12h各测1次c Tn。

c TnI和c Tn T是唯一存在于心肌中的收缩蛋白质,对心肌损伤或坏死有高度的敏感性和特异性。c TnI和c Tn T主要以细肌丝的结构蛋白质成分存在,仅3%~6%以游离形式存在于细胞质中,心肌损伤后首先释放到血液中的c Tn是细胞质中游离的部分。由于正常人血清中c Tn含量极低,即使少量的心肌坏死,血液中c Tn浓度也会明显升高。心肌缺血早期胞质中游离的c Tn快速释放入血,4~6h即可在血液中检测到有诊断意义的c Tn升高。如缺血加重造成不可逆心肌损伤时,心肌肌原纤维不断崩解破坏,存在于复合体中的c TnI和c Tn T持续、大量地释放入血,在心肌损伤后12~24h血液中c Tn达高峰。外周血中c Tn T主要以游离形式存在约占总c Tn T的95%,消除较快,5~10d恢复正常;而c TnI大部分以c TnI-c TnC复合物形式存在,占总c TnI的90%,释放入血,消除缓慢,持续时间为10~14d。由于c TnI-c TnC复合物中c TnC的保护作用,c TnI的中心区(第28-110位氨基酸)比较稳定,是制备抗体常选用的抗原决定簇区段。胸痛发作24h内,血清c Tn T对诊断AMI的敏感性和特异性分别为99%和93%,24h后的敏感性和特异性均为100%。c TnI仅存在于心肌内,其特异性、阴性预测率可达100%,尤其适用于AMI合并骨骼肌损伤的患者。c TnI的敏感性在AMI初期逊于肌红蛋白(Mb)、CK-MB,但出现症状后10~70h,c TnI的敏感性、特异性可达100%。若胸痛发作24h后,c Tn浓度正常可排除AMI。

2.测定方法

(1)心肌肌钙蛋白T(c Tn T)检测:自1986年推出c Tn T检测试剂以来,世界多个国家已经广泛应用血清c Tn T诊断AMI。近年发现应用c Tn T对不稳定型心绞痛病人监测可以发现一些轻度和小范围心肌损伤。

最初其检测方法是制备生物素标记鼠抗人c Tn T单克隆抗体,此抗体和慢收缩肌纤维(慢肌)的s Tn T有3.6%的交叉反应,最低检测限0.04μg/L。第二代试剂减少了和慢肌的交叉反应,最低检测限为0.02μg/L,99.6%非心脏病病人<0.1μg/L,心肌损伤的判断值(cut-off)> 0.08μg/L。最近已有电化学发光试剂盒,所用抗体同第二代,最低检测限为0.01μg/L,试验可在9min内完成。

参考区间:<0.1μg/L。

临床意义如下。

①c Tn T是当今公认的反映心肌梗死的“金标准”,是AMI的确定标志物。AMI发病后3~6h,血清c Tn T即升高,10~24h达峰值,峰值可为参考值的30~40倍,恢复正常需要10~ 15d。对Q波性、亚急性心肌梗死或CK-MB无法诊断的病人更有价值。

②c Tn T在判断微小心肌损伤方面也有价值。不稳定型心绞痛病人常发生微小心肌损伤,对于这种微小的心肌损伤,CK-MB常常不敏感,阳性率仅为8%,c Tn T对不稳定型心绞痛阳性率可达39%,这种损伤只有检测血清c Tn T才能确诊。

③c Tn T还可用于评估溶栓疗法成功与否,观察冠状动脉是否复通。溶栓成功的病例c Tn T呈双峰,第一个峰高于第二个峰。研究表明,用c Tn T评估复通,90min时优于CK-MB和肌红蛋白,如果结合其他诊断AMI指标,如12导联心电图的ST段变化,效果更好。

④c Tn T还常用于判断AMI面积大小,用放射性核素201 TI和99m Tc确定AMI面积并和心肌标志物比较,发现CK-MB、c Tn T和放射性核素检测结果的相关系数分别为0.56和0.75。

⑤对于心肌炎诊断,c Tn T比CK-MB敏感的多,84%心肌炎病人c Tn T升高,但是c Tn T阴性仍不能排除心肌炎的存在。

(2)心肌肌钙蛋白I(c TnI)检测:1987年首次报道c TnI的检测,用羊和兔的多克隆抗体放射免疫法测定人的c TnI,检测限为10μg/L,和s TnI交叉反应为2%。目前多采用化学发光法进行定量检测。

参考区间:<0.03μg/L,AMI诊断的Cut-off值为0.5μg/L。

临床意义如下。

①c TnI是一项十分敏感和特异的AMI标志物。心肌内c TnI很丰富,心肌损伤后4~6h释放入血,达到诊断决定值。首先释放的是胞质内3%~6%的游离c TnI,心肌缺血症状发作后14~36h达到高峰,高峰出现时间与血中CK、CK-MB相似。5~10d后恢复到正常参考区间,但部分病例14d仍升高。7d后,c TnI诊断AMI敏感性超过LD1/LD2。文献报道测定血清c TnI诊断AMI的敏感性为97%、特异性为98%、预测值为99.8%。

②和c Tn T一样,c TnI可用于溶栓后再灌注的判断,在成功溶栓使冠状动脉复通后30min、60min,c TnI还继续升高,其敏感性约为80%,高于CK-MB和肌红蛋白。

③c TnI可敏感地测出小灶可逆性心肌损伤,如不稳定型心绞痛和非Q波MI。不稳定心绞痛病人血中c TnI阳性率20%~40%,这类病人属高危者,30d和6个月内发生MI和死亡率均明显高于阴性者,必须及时应用经皮冠状动脉成形术(PTCA)或溶栓治疗。

应用评价:c Tn T和c TnI是心肌损伤的确诊性标志物,在众多标志物中特异性最高,具有灵敏度高、特异性强、升高幅度大、诊断窗口期长等特点。c TnI与c Tn T均具有以下共同特点:①由于心肌肌钙蛋白含量远多于CK,因而敏感度高于CK,不仅能检测出AMI病人,而且能检测微小损伤,如不稳定型心绞痛、心肌炎。②恰当选择肌钙蛋白特异的氨基酸序列作为抗原决定簇,筛选出的肌钙蛋白抗体,其检测特异性高于CK。③有较长窗口期,c Tn T长达7d, c TnI长达10d,甚至14d。有利于诊断迟到的AMI和不稳定型心绞痛、心肌炎的一过性损伤。④双峰的出现,易于判断再灌注成功与否。⑤肌钙蛋白血中浓度与心肌损伤范围有较好的相关性,可用于判断病情轻重,指导正确治疗;胸痛发作6h后,血中心肌肌钙蛋白浓度正常可排除AMI。⑥损伤发生6h内,敏感度较低,对确定是否早期使用溶栓疗法价值较小。⑦由于窗口期长,诊断近期发生的再梗死效果较差。

(二)肌红蛋白

1.概述 肌红蛋白(myoglobin,Mb)是存在于心肌和骨骼肌胞质中的亚铁血红素蛋白,心肌中含量比较丰富,其含量为骨骼肌3~9mg/g组织,心肌1.4mg/g组织。肌红蛋白由一条多肽链和一个血红素辅基构成,相对分子质量小(17 800),能可逆性与氧结合,在肌肉中有运输氧和储存氧的功能。正常人血清中肌红蛋白含量甚微,主要经肾排出,部分经网状内皮细胞代谢。

肌红蛋白是AMI血清中最早的生化标志物。在心肌梗死发生后1h,即开始从受损的心肌细胞中释放入血,2~4h在血液中明显升高,6~9h达高峰,24~36h恢复至正常水平。几乎所有的AMI血清肌红蛋白在6~10h均升高,故血清肌红蛋白正常可排除AMI。另外,肌红蛋白在血中清除迅速,发病24h内即可恢复正常,故肌红蛋白测定有助于观察心肌有无再梗死及梗死区有无再扩展。

AMI患者血清肌红蛋白的升高幅度和持续时间与梗死面积和心肌坏死程度呈明显正相关,一般心内膜下及大面积梗死,血清肌红蛋白升高可持续3~4d。如果血清肌红蛋白持续不降或反而升高,或下降后又异常升高,说明梗死继续扩大,心肌坏死加重或新梗死发生。

由于骨骼肌疾病、肾功能损害、炎症、系统性红斑狼疮(SLE)、皮肌炎均可引起肌红蛋白升高,其作为AMI的诊断指标特异性较低,容易引起AMI诊断的假阳性。因此,应用肌红蛋白诊断AMI时,必须结合临床症状和病史,排除引起血清肌红蛋白升高的其他因素,才能确定诊断。

2.测定方法 肌红蛋白测定方法较多,目前主要采用免疫化学法,包括放射免疫法、酶联免疫法、免疫比浊法、荧光免疫法和滴金免疫法等,商品化自动免疫分析可在10min内快速完成。目前较常用的为胶乳透射免疫比浊法,其灵敏度高、特异性好,测定快速,适于各类型自动生化分析仪。

参考区间:依测定方法不同而异。如免疫学方法,成年男性<80μg/L,女性<60μg/L。老年人血清肌红蛋白水平随年龄增加而逐渐轻度升高。

临床意义:肌红蛋白已列为常规早期心脏标志物。由于肌红蛋白在AMI发生时具有较高的灵敏度,一般可用于阴性诊断。心电图是临床诊断AMI的主要工具,但仍有37%急性AMI病人发病后无典型的特征性心电图表现。心电图结合肌红蛋白能提高AMI早期诊断的有效率,从72%升高至82%。由于肌红蛋白消除很快,是判断再梗死的良好指标,可出现新的肌红蛋白峰。

应用评价如下。

(1)优点:①在AMI发作12h内诊断敏感性很高,有利于早期诊断,是至今能用于AMI诊断最早的生化标志物;②用于判断再灌注是否成功;③用于判断再梗死;④在胸痛发作2~ 12h,肌红蛋白阴性可排除AMI诊断。

(2)缺点:①特异性较差,肌红蛋白不是心肌损伤的特异性指标,任何原因所致的骨骼肌损伤,甚至肌内注射、剧烈运动及肾功能排泄障碍,均可导致血清肌红蛋白升高;②窗口期太短,回降到正常范围太快,峰值在12h,AMI发作16h后测定易出现假阴性。

(三)肌酸激酶同工酶质量

1.概述 CK-MB为CK的同工酶,主要存在于心肌细胞中,心脏是体内含CK-MB最多的器官。肌酸激酶同工酶质量(CK-MB mass)检测指用免疫法测定CK-MB酶蛋白的含量,而非活性测定,以反映血清CK-MB的水平。在AMI发作3~5h开始升高,16~24h达高峰。CK半衰期10~12h,无再梗死或其他损伤,2~3d恢复正常。

利用酶免疫分析技术检测肌酸激酶同工酶质量,提高了CK-MB在AMI早期诊断和微小心肌梗死中的诊断敏感性(表11-5)。

表11-5　心肌梗死常用早期检测指标的平均诊断敏感性(%)

2.测定方法

(1)全血快速定性试验:原理为固相免疫层析法。吸取肝素化或EDTA抗凝的全血150μl加入样本孔,由于膜的作用将血细胞同血浆分离(3min内),定量的血浆随后发生迁移,CKMB同染料标记的抗体结合,形成的复合物再与固相载体结合的抗CK-MB抗体结合。过量的标记抗体继续移动,在质控区结合形成沉淀线。阳性检测结果会出现两条沉淀线。一条是质控线,另一条是样本检测线。

(2)定量:双抗体夹心免疫分析法。

参考区间:<5~8μg/L(取决于不同的厂家)。

临床意义:缺血性心脏疾病和非缺血性心脏疾病在阳性率、升高倍数等方面,肌酸激酶同工酶质量检测的假阳性率明显低于CK-MB酶活性检测。在胸痛发作最初6h内,肌酸激酶同工酶质量的敏感性明显优于CK-MB活性检测,特别适用于AMI患者和伴有较明显肺部感染的心肌缺血患者的临床实验诊断。由于CK-MB活性检测存在许多不足,现逐渐被肌酸激酶同工酶质量检测所替代,目前倾向用肌酸激酶同工酶质量测定作为心肌损伤的常规检查项目之一。