血清脂肪酶活性测定

脂肪酶(lipase,LPS)又称三酰甘油酶,是胰腺外分泌酶,可水解长链脂肪酸甘油酯。血清脂肪酶主要来源于胰腺,也来自于其他组织(如胃、小肠黏膜等)。由于LPS仅作用于酯和水交界面的脂肪,只有当底物呈乳化状态脂肪酶才发挥作用。因此必须有胆汁酸盐、脂肪酶、Ca2+及辅脂酶(colipase)的共同参与,脂肪酶才能发挥最大的催化活性及特异性。胆汁酸盐可清除底物-水界面的蛋白质,并促进脂肪酶与胆汁酸-共脂肪酶结合。在胆汁酸-共脂肪酶-脂肪酶结合物中,脂肪酶才能催化底物水解。Ca2+在胆汁酸盐存在下,能促进酶对底物的结合,缩短酶促反应的延滞期。

血清脂肪酶活性的测定方法有多种,如滴定法、p H电极法、荧光法、分光光度法、比浊法、酶偶联法等。目前多采用酶偶联法或比浊法。

(一)酶偶联法

【原理】 反应式如下

在546nm处,用光径为1.0cm比色杯进行比色,计算脂肪酶的活性单位。

TOOS:4-aminophenazone,N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine,N-乙酰-N-磺酸丙基苯胺。

【单位定义】 在规定条件下,37℃每分钟水解底物(1,2-甘油二酯)释放出1μmol/L 2-单酸甘油酯所需的酶量,为1个酶活性单位,用1L血清中的酶量表示(U/L)。

【参考区间】 酶偶联法:1~54U/L。

【应用评价】 本法线性范围为0~1 500 U/L,批内CV 2.3%~3.1%,批间CV 3.8%~ 5.2%。胆红素>50μmol/L无干扰,浓度在51~307μmol/L时,结果可降低10%~15%;游离甘油浓度>0.4mmol/L有明显的正干扰。

(二)比浊法

【原理】 三酰甘油与水制成乳胶液,因胶束对入射光的吸收和散射而产生浊度,胶束中的三酰甘油经脂肪酶水解,使胶束分裂,浊度或光散射减低,其速率与脂肪酶活性有关。

【试剂】

1.纯化橄榄油 称取色谱纯化的氧化铝(70~325筛孔)10g,置于2cm×15cm色谱柱中,使呈疏松及表面平整状态,缓慢加入AR级橄榄油18ml,用橡皮冲洗球加压,色谱除去游离脂肪酸,得到无色透明的橄榄油约10ml,氧化铝转变成黄色。

2.橄榄油乙醇液 称取纯化处理的橄榄油2g,溶于无水乙醇中,加无水乙醇至200ml。

3.Tris-HCl缓冲液(p H 8.8) 称取Tris3g,去氧胆酸钠6g,溶于蒸馏水中,稀释至1L,用浓盐酸调p H8.8。

4.0.17μmol/L橄榄油乳剂 取500ml Tris-HCl缓冲液于烧杯内,置于磁力搅拌器上,缓缓加入7.5ml橄榄油乙醇液(吸管尖端应插入液面以下),搅拌至呈均匀乳浊液,冰箱保存。

【操作】

1.于试管内加入4ml橄榄油乳剂,37℃水浴预温5min,加入血清0.05ml,立即颠倒混匀5次(勿用力振摇!),以Tris缓冲液调零点,迅速用分光光度计于400nm处比浊,读取第一次吸光度(A 1)。

2.将此管置37℃水浴,保温10min,读取第二次吸光度(A 2)。

3.当淀粉酶活性很高,保温期间底物全部变清,应将待测血清用Tris缓冲液作适当稀释后重新测定。

4.标准曲线制作。取试管4支,分别加入橄榄油乳剂1.0ml、2.0ml、3.0ml及4.0ml,用Tris缓冲液补充至4.0ml,相当于三酰甘油浓度分别为0.17μmol/L、0.34μmol/L、0.51μmol/ L和0.68μmol/L,同上比浊,绘制标准曲线。

【单位定义】 100ml血清,经37℃水浴,作用于底物10min,能水解1μmol底物所需的酶量,为1个脂肪酶活性单位。

【计算】 由(A 1-A 2)之值查标准曲线,即得酶水解底物μmol数。

脂肪酶单位=酶水解底物的微摩尔数×100/0.05,如样本稀释后测定,结果乘以稀释倍数。

【参考区间】 酶活性呈正偏态分布,0~7.9U。

【质量保证】

1.脂肪酶测定可用橄榄油或三酰甘油作底物,市售橄榄油必须用氧化铝吸附,除去游离脂肪酸,否则测定结果仅为真实活性的65%。

2.5%~7%健康人的血清与底物保温后吸光度有所增加,造成负值。向血清中加入聚乙二醇6000,使终浓度达55g/L,温育10min,使干扰物(如Ig M)沉淀或解离后再行测定。

3.比浊法不易制备稳定而又能获得重复结果的底物液,若底物浓度过大,可因初始吸光度过高而降低灵敏度。

【临床意义】 血清脂肪酶活性测定可用于胰腺疾病的诊断,尤其是急性胰腺炎,常于发病后4~8h血清脂肪酶活性升高,24h达峰值,一般持续8~14d,其升高程度常与淀粉酶平行。急性胰腺炎测定脂肪酶比淀粉酶更敏感(80%~100%)和特异(84%~96%)。

血清脂肪酶升高也见于急腹症、慢性肾病等,但腮腺炎和巨淀粉酶血症不升高,这与淀粉酶不同,可用于鉴别诊断。在白细胞、脂肪细胞及乳汁中也可测到脂肪酶活性。脂肪酶可经肾小球滤过,并被肾小管全部重吸收,故正常尿中测不到脂肪酶活性。