转录产物的加工

真核生物基因转录的直接产物一般是无功能的，称为初级转录产物（primary transcripts），需在细胞核内进行加工修饰，成为成熟的RNA，具有活性，才能发挥各自的功能。真核生物的转录后加工修饰远比原核生物复杂，不同RNA的加工方式不同。

（一）mRNA前体的转录后加工

真核生物mRNA的初级转录产物是hnRNA，称为杂化核RNA（hetero-nuclear RNA，hnRNA），mRNA的加工包括5′端加帽、3′端加poly（A）尾、剪接（splicing）以及编辑（eduting）等。

1．5′端帽子结构的形成（图5-4） mRNA前体的5′端为pppNp-，RNA链开始合成后不久，经磷酸酶催化水解，释放出Pi，5′端成为ppNp-；在鸟苷酸转移酶催化下，与一分子三磷酸鸟苷酸反应，末端成为GpppNp-，加上去的鸟苷酸与原5′末端的核苷酸不是以3′，5′-磷酸二酯键连接，而是通过5′磷酸基团相连，因此，加帽后的5′端仍具有3′-OH和2′-OH。mRNA前体的5′端加上鸟苷酸后，在甲基转移酶催化下，由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）供给甲基，在鸟嘌呤的N-7上甲基化，成为m7 GpppNp-，这就是mRNA5′末端的帽子结构，称为帽子0型结构。

图5-4　真核细胞mRNA的加帽反应

连于鸟苷酸的第一个或第二个核苷酸的2′-OH也可以被甲基化，连于鸟苷酸的第一个核苷酸2′-OH被甲基化，称为Ⅰ型帽子结构，若第一个核苷酸和第二个核苷酸的2′-OH都被甲基化，则称为Ⅱ型帽子结构。

2．3′端多聚腺苷酸的加入（图5-5） mRNA3′端的多聚腺苷酸（poly A）尾巴是转录后加上去的，在模板链上没有相应的polyT序列。mRNA3′端加poly（A）尾的反应是在细胞核内完成的。在结构基因最后一个外显子的3′端，常有一组共同序列AATAAA，其下游还有相当多的GT序列，这些序列称为转录终止的修饰点。当转录中的mRNA前体出现加尾信号（AAUAAA及其下游的GU丰富区或U丰富区）时，即可被几个蛋白因子识别并结合。

哺乳动物mRNA在加尾信号部位的断裂需要几个蛋白质的作用。

（1）断裂与多聚腺苷酸化特异性因子（cleavage and polyadenylation specificity factor，CPSF），为加poly（A）尾所必需的蛋白，CPSF的作用是识别并结合AAUAAA信号。

（2）断裂刺激因子（cleavage stimulation factor，CstF），也参加识别多聚腺苷酸化位点，CstF结合于GU丰富区。CPSF和CstF结合于mRNA的断裂和多聚腺苷酸化位点的两侧，两个因子单独与mRNA结合都是不稳定的，同时结合则可协同作用，形成稳定的复合物。

图5-5　真核细胞mRNA加尾反应模式

（3）断裂因子Ⅰ和Ⅱ（cleavage factorⅠ，CFⅠ和cleavage factorⅡ，CFⅡ），为特殊的内切核酸酶，负责剪切反应。

（4）poly（A）聚合酶也可能参与mRNA断裂过程，因为mRNA一断裂，加A的反应就立即开始，没有时间间隔。

当上述几种因子结合于mRNA后，即可在AAUAAA下游10～30个核苷酸处将mRNA切断，poly（A）聚合酶随即以ATP为底物，在mRNA的3′末端催化合成poly（A）。加A过程分为两个阶段，第一阶段是起始阶段，在mRNA3′端缓慢加上至少10个A，此阶段依赖于AAUAAA和CPSF；第二阶段是延长阶段，不依赖AAUAAA，而是依赖于第一阶段加的oligo（A），当oligo（A）形成后，poly（A）-结合蛋白Ⅱ［poly（A）-binding proteinⅡ，PABPⅡ］与之结合，促进poly（A）聚合酶的加A反应，第二阶段的反应很快，在mRNA的3′末端加上200多个A。

一般真核生物在胞质中出现的mRNA的poly（A）长度在100～200个核苷酸之间。也有少数例外，如组蛋白基因的转录产物，无论是初级的或成熟的都没有poly（A）尾。

3．mRNA前体的剪接 1977年，Philip Sharp和Richard Roberts在研究腺病毒基因时发现表达蛋白质出现断裂现象，即基因中间被一些不能表达蛋白质的核苷酸所隔开，致使一个结构基因被断裂为若干部分。进一步研究表明，基因断裂是真核细胞及其病毒基因组中的普遍现象，这种不连续的被若干序列区域分隔开的结构基因称为断裂基因。断裂基因由外显子（exon）和内含子（intron）两部分组成，分别表示基因的编码序列和非编码序列，在转录过程中内含子和外显子一同被转录，形成初级RNA，初级RNA需要经过剪接加工，以除去内含子序列，并将相关的外显子序列连接成为成熟的有功能的mRNA分子。

不同的断裂基因所含有的内含子数目不一定相同，内含子的大小也变化不定。一般来说，内含子的数量和长度都非常大，初始转录产物会很长，转录后加工时必须剪切除去。以鸡卵清蛋白为例，其基因长达7．7×103nt，有6个内含子，经过剪接后，成熟的mRNA只有1 872nt（图5-6）。

图5-6　鸡卵清蛋白基因结构及其mRNA的后加工

mRNA前体的剪接是高度精确的，一方面取决于外显子和内含子交界处的剪接信号，另一方面取决于5种被称为snRNA的核糖核酸蛋白质复合物。

（1）mRNA前体中内含子的剪接位点：通过比较多种蛋白质基因剪接位点周围的核苷酸序列发现，内含子具有相同的开始和结尾，即总是由GU开始，以AG结尾，此规律称为“GUAG”规律。内含子含有3个保守序列：内含子的5′-端剪接点由GUAAGU组成；3′-端剪接点由（Py）nNPyAG组成，n大约为10，N为任意碱基，Py指嘧啶；3′-端上游18～40个核苷酸处也有一个保守序列，称为分支点（branch site），在酵母细胞是由UACUAAC组成，保守性极强，哺乳动物分支点序列保守性较差。

（2）snRNA：真核细胞的细胞核内含有许多高度保守的小分子RNA（一般≤300碱基），这些RNA统称为snRNA（small nuclear RNA）。在mRNA剪接过程中至少有5种snRNA，包括U1、U2、U4、U5和U6snRNA。这些snRNA分别与特异蛋白质结合成细胞核小分子核糖核蛋白颗粒（snRNP），参与mRNA前体的剪接过程。除了snRNA之外，参与剪接作用的还有若干非snRNA的剪接因子，如SR蛋白（其C端结构域富含Ser和Arg的区域）。snRNA与剪接因子结合构成剪接体。剪接体是mRNA前体在剪接过程中由snRNA和蛋白质组装形成的具有催化剪接反应的多组分复合物。

（3）剪接体的组装及剪接过程：剪接体是剪接反应的场所，它的组装是一个有序、耗能的过程，而其本身也处在动态变化之中。剪接体的组装、发挥剪接作用和解体称为剪接体循环（spliceosome cycle）。通过控制剪接体的组装，细胞可以调节剪接的质量和数量，从而调节基因表达：①组装是从U1与剪接底物（RNA）开始，U1snRNP识别并结合于内含子的5′端剪接点（GU及其邻近序列）。②U2snRNP识别并结合于分支点（此过程需要ATP）。③U4／U6和U5snRNP加入。④U4随后与U6解离，使U2和U6能够通过碱基配对而结合，至此，剪接体全部组装完毕。此时U2和U6snRNP形成催化中心，催化磷酸酯键转移反应。在剪接体上进行的剪接作用，既无水解反应，又无磷酸二酯键数目的改变，剪接反应实际上是转酯反应。⑤通过水解ATP提供能量，完成第一步转酯反应。内含子分支点中A的2′-OH与内含子5′端G的5′-磷酸基团通过转酯反应而结合，形成2′，5′-磷酸二酯键，内含子自身成环，形成套索结构，称套索（lariat）RNA结构。⑥第二次转酯反应亦需要水解ATP提供能量，内含子上游外显子的3′-OH与下游外显子第一个核苷酸的5′-磷酸基团通过转酯反应而结合，形成3′，5′-磷酸二酯键，两个外显子即以磷酸二酯键相连。⑦剪接反应完成后，剪接体所有成分解体，可被再用于形成其他的剪接中间体（图5-7）。

图5-7　mRNA的剪接

4．RNA的编辑（RNA editing） 这是RNA转录后改变mRNA序列的一种加工修饰方式。有一些基因的mRNA在转录后因插入、缺失或替换一些核苷酸而改变了模板DNA来源的遗传信息，从而翻译出许多氨基酸序列不同的蛋白质。

1896年，Benne R所研究的原生动物鞭毛虫的锥体虫线粒体mRNA的编辑加工是目前研究得较详细的一个例子。线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅱ的成熟mRNA的编码区序列比其基因的编码链多出4个U（图5-8），在排除其他因素后，发现这4个U是在转录后添加进去的。

图5-8　锥体虫线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅱ的mRNA序列与其基因编码链序列的比较

RNA编辑的方式主要有两种：一种是在编码区增减一定数目的核苷酸，如绒泡菌线粒体中发现胞苷酸残基（C）的插入编辑，疱疹病毒mRNA中发现鸟苷酸残基的插入编辑。另一种是编码区的碱基发生转换或颠换，如载脂蛋白B mRNA中发现C→U取代编辑。介导RNA编辑的机制也有两种：依赖于指导RNA（guide RNA，gRNA）的编辑和依赖于特定的核苷酸脱氨酶的编辑。RNA编辑的生物学意义在于RNA编辑增加转录产物的多样性，扩大遗传信息；补救某种基因突变，恢复突变中丢失的遗传信息，改变和补充遗传信息的功能；赋予转录产物新的序列，有利于生物进化。

（二）tRNA前体的转录后加工

真核生物多数tRNA前体分子含有内含子，也需通过剪接作用才能变成成熟tRNA。tRNA前体的转录后加工方式有：剪接去除内含子、剪切5′端先导序列、添加或修复3′端CCA以及碱基的化学修饰等。

1．tRNA前体的剪接 tRNA前体的剪接作用是在两种不同酶的作用下完成的，先由内切核酸酶催化进行剪切反应，再由连接酶将外显子连接起来。如酵母酪氨酸tRNA前体有一个14核苷酸的内含子，位于反密码子3′侧，其剪接作用即分两步进行。先由一种与膜结合的内切核酸酶把内含子从tRNA前体上切下，使tRNA前体分成5′端半分子和3′端半分子，然后由ATP提供能量，RNA连接酶把两个半分子连接成为成熟的tRNA（图5-9）。

图5-9　酵母酪氨酸tRNA的加工

2．切除5′端先导序列 除了剪接反应外，真核细胞tRNA前体也存在剪切加工。如酵母酪氨酸tRNA前体5′端有一段由16nt组成的核苷酸序列，称为先导序列（leader sequence）。该序列是由内切核酸酶RNase P水解切除的。

3．添加或修复3′端CCA序列 真核细胞tRNA前体在tRNA核苷酸转移酶催化下，将3′端除去两个U，由CTP、ATP提供C和A，加上CCA序列，形成氨基酸的结合位点。

4．化学修饰 真核生物tRNA前体的加工也存在着化学修饰反应，如甲基化反应：由tRNA甲基转移酶催化某些嘌呤生成甲基嘌呤；还原反应：通过还原反应使某些尿嘧啶还原为双氢尿嘧啶（DHU）；核苷内转位反应：通过核苷内的转位反应使尿嘧啶转变为假尿嘧啶核苷（ψ）；脱氨基反应：在脱氨酶催化下腺苷酸脱氨基成为次黄嘌呤核苷酸（I）等。

（三）rRNA前体的转录后加工

rRNA前体的加工主要是前体的剪接和化学修饰。

1．rRNA前体的剪接 在哺乳动物基因组中，28S、18S和5．8SrRNA基因串联在一起形成一个转录单位，在基因组中重复几百次，即每个基因有几百个拷贝。每个转录单位之间的间隔DNA序列称为非转录间隔序列（nontranscribed spacers），而一个重复单位内的3个基因之间的间隔序列则是与基因一起转录的，称为转录的间隔序列（transcribed spacers），这些序列在转录后加工过程中被切除。哺乳动物的RNA聚合酶Ⅰ转录产物是45S的rRNA前体，其中含有28S、18S和5．8SrRNA。rRNA前体的剪接是通过“自我剪接”（self-splicing）机制进行的，此过程需要一种核仁小RNA（small nucleolar RNA，snoRNA），snoRNA参与rRNA前体的加工，并指导核糖和碱基的修饰。剪接过程的第一步是剪掉5′末端序列，形成41S的中间体；随后将41SRNA裂解成32S（含有28S和5．8SrRNA）和20S（含有18SrRNA）两段；最后，32SRNA经裂解和修剪，产生28S和5．8SrRNA（可互补结合），20SRNA经修剪后产生18SrRNA。

2．化学修饰 rRNA前体加工的另一种重要形式是化学修饰，主要是甲基化反应。甲基化主要发生在核糖的2′-OH，甲基化可能是作为rRNA前体剪接加工的信号。此外，rRNA前体中的一些尿嘧啶核苷酸通过异构作用可转变为假尿嘧啶。5SrRNA转录产物无需加工，与28SrRNA、5．8SrRNA以及多种蛋白质分子一起组装成为核糖体大亚基后，再转移到胞质。