初级代谢的调控机制和调控解除

产生初级代谢产物的代谢称为初级代谢。微生物在生长期产生的对自身生长和繁殖必需的产物称为初级代谢物（primary metabolites）。初级代谢是细胞维持生命活动最基本的必需代谢，包括糖、脂、蛋白质等物质的降解与产能的分解代谢，及以分解代谢为基础的细胞生长发育所必需的合成与耗能代谢。

细胞代谢中生化反应的进行都是以酶的催化为基础的。酶量的有无与多少、酶活性的高低是一个反应能否进行与反应速率高低的决定因素。因此，对催化某个具体反应的酶的合成与活性的调节，即可调控该步生化反应。在这里，酶量的有无与多少的调节主要是指发生在基因表达水平上的以反馈阻遏与阻遏解除为主的调节。酶活性的调节主要是指发生在酶分子结构水平上的调节，包括酶的激活和抑制两个方面。在代谢调节中，酶活性的激活是指在分解代谢途径中，后步的反应可被较前面的中间产物所促进，称为前体激活。酶活性的抑制主要是反馈抑制（feedback inhibition），主要表现在某代谢途径的末端产物（即终产物）过量时，这个产物可反过来直接抑制该途径中关键酶的活性，促使整个反应减慢或停止，从而避免末端产物的过多累积。反馈抑制具有作用直接、快速以及当末端产物浓度降低时又可自行解除等特点。反馈阻遏与反馈抑制的特点比较见表4-12。

表4-12 反馈阻遏与反馈抑制的特点比较

（一）氨基酸生物合成的反馈抑制调节

1.单一终端产物途径的反馈抑制

E.coli在由苏氨酸合成异亮氨酸时，终产物（E）异亮氨酸过多可抑制途径中第一个酶———苏氨酸脱氨酶的活性，导致异亮氨酸合成停止，这是一种较为简单的终端产物反馈抑制方式，见图4-26（⊖ ：表示抑制）。

图4-26 单一终端产物途径的反馈抑制

2.多个终端产物对共同途径同一步反应的协同反馈抑制

合成途径的终端产物E和H既抑制在合成过程中共同经历途径的第一步反应的第一个酶，也抑制在分支后第一个产物的合成酶。如谷氨酸形成谷氨酰胺的第1步反应中起催化作用的酶，即谷氨酰胺合成酶受到8种产物的反馈抑制。谷氨酰胺合成酶是催化氨转变为有机含氮物的主要酶。该酶活性受到机体对含氮物需求状况的灵活控制。大肠杆菌的谷氨酰胺合成酶结构及其调控机制已得到阐明。该酶由相对分子质量为51600的12个相同的亚基对称排列成2个六面体环棱柱状结构。其活性受到复杂的反馈控制系统以及共价修饰调控。已知有8种含氮物以不同程度对该酶发生反馈别构抑制效应。每一种都有自己与酶的结合部位。这8种含氮物是葡萄糖胺-6-磷酸、色氨酸、丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、胞苷三磷酸、AMP及氨甲酰磷酸。谷氨酰胺合成酶的调节机制，是氨基酸生物合成调控机制复杂性的典型例子，见图4-27与图4-30。

图4-27 多个终端产物对共经途径同一步反应的协同反馈抑制

3.不同分支产物对多个同工酶的特殊抑制

不同分支产物对多个同工酶的特殊抑制，也称酶的多重性抑制（enzyme multiplicity feed-back inhibition）。如A形成B由两个酶分别合成，两个酶分别受不同分支产物的特殊控制。两个分支产物又分别抑制其分道后第一个产物E和F的形成。由赤藓糖-4-磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸形成3种芳香族氨基酸的途径中可见这种多重性抑制（见图4-28、4-31和4-32）。

图4-28 不同分支产物对多个同工酶的特殊抑制

4.连续反馈控制

连续反馈控制（sequential feedback control）又称连续产物抑制（sequential end product inhibition）或逐步反馈抑制（step feedback inhibition）。反应途径的终端产物E和H只分别抑制分道后分支途径中第一个酶e和f的活性。共经途径的终端产物D抑制全合成过程第一个酶的作用。这种抑制的特点是由于E对e酶的抑制致使D产物增加，D的增加促使反应向D→F→G→H方向进行，而使产物H增加，而H又对酶f产生抑制，结果也造成D物质的积累，D物质反馈抑制a酶的作用，而使A→B的速度减慢（见图4-29）。

图4-29 连续反馈控制

枯草芽孢杆菌（Baciluus subtilis）的芳香族氨基酸生物合成的反馈抑制就属于这种类型。

色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸分支途径的第一步都分别受各自终产物的抑制。这3种终端产物都过量，则分支酸积累。分支点中间产物积累使共经途径催化第一步反应的酶受到反馈抑制，从而抑制赤藓糖-4-磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸的缩合反应（见图4-31）。

以天冬氨酸为底物合成赖氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸的过程出现有各种类型的抑制现象（图4-32）。

但是，并非所有氨基酸的生物合成都受最终产物的反馈抑制，丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸这3种在中心代谢环节中的关键中间产物就是例外。这3种氨基酸是靠与其相对应的酮酸的可逆反应来维持平衡的。另有甘氨酸的合成酶也不受最终产物抑制，它可能受到一碳单位和四氢叶酸的调节。

图4-30 八种含氮化合物生物合成的反馈控制

上述氨基酸生物合成的反馈抑制调节方式的分类是相对的，事实上，如图4-31、4-32所示，某些情况下存在多种方式的协同调节。

（二）酶生成量的改变对氨基酸生物合成的调节

在某些氨基酸的生物合成中，如某一氨基酸合成的量超过需要量时，则该氨基酸合成的关键酶的编码基因转录受阻遏，从而酶的合成也被抑制。而当合成的氨基酸产物浓度下降时，则这一氨基酸合成有关酶的基因转录阻遏被解除，关键酶的合成又开始，随后氨基酸的生物合成也随之重新开始。可见这种调控主要是通过对有关酶的编码基因的活性调节来实现的。它是发生在基因表达水平上的调节，而不是通过酶分子的变构来调节。

图4-31 三种氨基酸生物合成分支途径的反馈控制

图4-32 五种氨基酸生物合成的反馈控制

氨基酸的生物合成途径中，有些酶能够受到细胞内相应氨基酸合成量的间接调控，这种酶称为阻遏酶（repressible enzyme）。例如，大肠杆菌由天冬氨酸衍生的几种氨基酸的合成过程中（图4-32）A、B、C的3种酶属于阻遏酶，而不属于变构酶，它们的调控靠细胞对该酶的合成速度的改变来实现。当甲硫氨酸的量足够时，控制同工酶A和B合成的相关基因的表达受到阻遏。同样当异亮氨酸的合成足够时同工酶C的合成速度就受到阻遏。通过阻遏与去阻遏（derepression）调控氨基酸的生物合成，一般比酶的别构调控缓慢。

在生物细胞内，20种氨基酸在蛋白质生物合成中的需要量都以准确的比例提供，故生物机体不仅有个别氨基酸合成的调控机制，还有各种氨基酸在合成中合成量比例的相互协调（coordination）的调控机制。

（三）核苷酸生物合成的反馈调节机制

1.嘌呤核苷酸生物合成的调节

在微生物中，嘌呤核苷酸生物合成受两个终产物的反馈控制，这两个终产物分别为腺苷酸和鸟苷酸。主要有3个控制点：第一个控制点在合成途径的第一步反应，即氨基被转移到5-磷酸核糖焦磷酸上，以形成5-磷酸核糖胺。此反应是由一种变构酶，即磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶所催化，它可被终产物IMP（inosine monophosphate，次黄苷酸，也称肌苷酸）、AMP和GMP所抑制。因此，无论是IMP、AMP或是GMP的过量积累均会导致由PRPP（phosphori-bosyl pyrophosphate，磷酸核糖焦磷酸）开始的合成途径中的第一步反应受到抑制。另两个控制点分别位于次黄苷酸后分支途径中的第一步反应，当GMP过量时，GMP可使催化该步的酶，即次黄嘌呤核苷酸脱氢酶发生变构效应，但仅抑制GMP的形成，而不影响AMP的形成。反之，AMP的积累抑制腺苷酸琥珀酸合成酶，从而抑制其自身的形成，而不影响GMP的生物合成。不同生物的调节方式略有不同。大肠杆菌中嘌呤核苷酸生物合成的反馈控制机制见图4-33。

2.嘧啶核苷酸生物合成的调节

以大肠杆菌为例，嘧啶核苷酸生物合成的调节机制见图4-34。从图可见，嘧啶核苷酸的生物合成，受到终产物反馈控制的点有三个：合成途径的第一个调节酶是氨甲酰磷酸合成酶，它受UMP的反馈抑制；另两个调节酶是天冬氨酸转氨甲酰酶和CTP合成酶，它们都受CTP的反馈抑制。前者被抑制将影响尿苷酸和胞苷酸的合成，后者被抑制只涉及胞苷酸的合成。

图4-33 嘌呤核苷酸生物合成的反馈控制

图4-34 嘧啶核苷酸生物合成的反馈控制

（四）初级代谢的调控解除及其在生产中的应用

以1956年谷氨酸发酵技术的产业化为标志，发酵工业进入第3个转折期———代谢控制发酵时期，其核心内容为代谢控制技术，并在其后的年代里该技术得到了飞速的发展和广泛的应用，取得了引人注目的成就。

1.用营养缺陷型解除调控的发酵生产应用

如赖氨酸的发酵生产即是运用营养缺陷型解除调控的一个实例。赖氨酸是人体必需的八种外源性氨基酸之一，但在植物蛋白中含量较少，是谷类蛋白质的第一限制氨基酸。因此，在食品、医药、畜牧业上有很大的需求量。在正常微生物细胞内，以天冬氨酸为底物的分支途径，其终产物主要有赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸与异亮氨酸。赖氨酸的生物合成途径与调控见图4-32。对赖氨酸生物合成的反馈控制点主要有两步：一是从天冬氨酸合成天冬氨酰磷酸这一步，其由天冬氨酸激酶（aspartokinase，简称AK）催化，AK受赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸的反馈抑制与阻遏作用。二是中间产物天冬氨酸半醛合成赖氨酸的反应。从这一代谢途径可见，以天冬氨酸为底物同时要合成赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸等产物。由于这四种产物存在对关键酶AK的连续反馈抑制与阻遏作用，因此赖氨酸在正常细胞内的浓度是非常低的。

以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）为出发菌株，通过遗传育种手段，使该菌株催化天冬氨酸半醛合成高丝氨酸的酶高丝氨酸脱氢酶的合成受阻，从而中断了此步合成反应，筛选获得了高丝氨酸缺陷型菌株，解除了大部分正常的反馈抑制，获得赖氨酸的高产菌株（见图4-32）。但由于该菌株不能合成高丝氨酸脱氢酶，故不能合成高丝氨酸，也就不能产生苏氨酸和甲硫氨酸，细胞的正常生长繁殖不能进行，因此需要在培养基中补给适量（不构成反馈抑制的浓度）的高丝氨酸或苏氨酸和甲硫氨酸，以保证有足够的新增细胞量，从而生产大量的赖氨酸。

2.反馈调节抗性突变株的发酵生产应用

苏氨酸的发酵生产是通过获得抗反馈调节的突变株解除反馈调节。抗反馈调节突变株是指一种对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性的组成型菌株，或兼而有之的菌株。因其反馈抑制或阻遏已解除，或两者同时解除，所以能累积大量末端代谢物。黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）的抗α-氨基-β-羟基戊酸（AHV）突变株能累积苏氨酸。由于该抗性突变株的高丝氨酸脱氢酶已不再受苏氨酸的反馈抑制，从而可使发酵液中苏氨酸浓度达到13g／L。通过对此突变株的进一步诱变而获得的甲硫氨酸缺陷菌株，由于它已解除了甲硫氨酸对合成途径中的两个反馈阻遏点（见图4-32，其中A、B是甲硫氨酸过量时受到阻遏的同工酶），因此其苏氨酸浓度可达18g／L。

3.细胞膜通透性的调节及其在生产中的应用

细胞膜对于细胞内外物质的运输具有高度选择性。如细胞内累积的某一代谢产物浓度超过一定限度时，细胞会自然地通过反馈抑制或阻遏限制其进一步合成。在实际研究和生产过程中，可采取生理或遗传学手段，改变细胞膜的通透性，使胞内的代谢产物快速渗漏到胞外，从而降低细胞内代谢物浓度，解除代谢物的反馈抑制和阻遏，便可提高发酵产物的产量。

一般可通过限制与细胞膜成分合成有关的营养因子浓度或筛选细胞膜组分合成缺陷型突变株等，使细胞膜的通透性改变。如在谷氨酸发酵生产中，控制培养基中生物素在亚适量浓度，可促使细胞分泌出大量的谷氨酸。研究发现，用C.glutamicum进行谷氨酸发酵，控制培养基中生物素浓度为0、2.5和10.0μg／mL时，发酵液中谷氨酸量分别为1.0、30.8和6.7 mg／mL。因为生物素是乙酰-CoA羧化酶的辅基，乙酰-CoA羧化酶是细胞脂肪酸生物合成的关键酶，它可催化乙酰-CoA的羧化并生成丙二酸单酰-CoA，进而合成细胞膜磷脂的主要成分脂肪酸。人为控制细胞环境中的生物素浓度可改变细胞膜组分，从而使细胞膜通透性改变，增强细胞对谷氨酸的分泌，克服细胞因胞内谷氨酸浓度较高而造成的反馈调节与合成抑制。而当培养液内生物素含量过高时，细胞膜的结构比较致密，对谷氨酸的分泌有一定阻碍，易引起胞内谷氨酸合成的反馈抑制。又可在培养基中加入适量青霉素，抑制细菌细胞壁肽聚糖合成中的转肽酶活性，引起肽聚糖结构中肽桥交联受阻，使细胞壁的结构适度缺损，有利于代谢产物外渗，也能降低谷氨酸的反馈抑制。采取上述生理生化手段，可达到有效提高谷氨酸产率的目的。另外，如诱变选育获得的青霉素高产菌株中，有些突变株就是由于改变了细胞膜的通透性，使硫酸盐更易透过细胞膜，提高了胞内硫酸盐浓度，进而促进了青霉素前体物半胱氨酸的合成，增加了合成青霉素的前体物，最终使青霉素的产量有所提高。