吸收至生物体内的硝酸盐经历着两种途径的变化：其一是植物和微生物将硝酸盐吸收至体内后，将它们还原成铵，然后参与合成细胞的含氮组分，这个过程称为同化型硝酸盐还原作用（assimilatory nitrate reduction）。其二是某些微生物在无氧或微氧条件下将NO3－或NO2－作为最终电子受体进行厌氧呼吸代谢，从中取得能量，硝酸盐还原生成N2O，最终生成N2的过程称为反硝化作用或脱氮作用。这个过程叫做异化型硝酸盐还原作用（dissimilatory nitrate reduction）。
1.反硝化作用
反硝化作用需要具有反硝化微生物，适合的电子供体如含碳化合物、还原型硫化物和氢等，无氧环境条件以及含氮氧化物。
在反硝化过程中，电子从“还原性”的电子供体物质通过一系列电子载体传递给一个氧化性更高的氮氧化物。当电子传递给某几个氮氧化物时，能量被电子转移磷酸化作用形成ATP。其终产物则因不同的作用菌而有所不同。
NO3－→NO2－→NO→N2O→N2
硝酸盐还可异化还原生成铵。在富含NO3－而贫碳的培养基中，反硝化作用占优势；而在富NO3－富碳的培养基中，则以生成NH4＋作用居主导。NO3－还原成NH4＋对土壤的保氮具有重要意义。
2.参与反硝化作用的微生物
能参与反硝化作用的微生物在自然界普遍存在。Ingraham（1981）指出有71个属菌能进行反硝化作用，它们在土壤中很丰富，占细菌群落的40％ ～65％ ，细菌数高达108个／g土。到目前为止，尚未发现细菌以外的其他生命形式能够进行反硝化作用。
一般反硝化作用均以NO3－为最终电子受体，但产碱杆菌（Alcaligenes）和黄杆菌（Fla-vobacterium）以及奈氏菌（Neisseria）的一些种不能还原NO3－，而却可从NO2－开始还原。
3.反硝化作用中的还原酶
（1）硝酸还原酶（NaR）
硝酸还原酶是催化NO3－还原为NO2－的专性酶。同化性和异化性的硝酸还原酶是由不同基因编码的不同蛋白质。异化性硝酸还原酶结合于膜的内表面。硝酸还原酶含有铁、硫和钼等元素。
（2）亚硝酸还原酶（Ni R）
亚硝酸还原酶催化NO2－还原为气态氮氧化物。亚硝酸是一个支点，从这一点可转向同化性反硝化形成羟胺，再还原为氨。因此，亚硝酸还原酶的存在可阻止同化性反硝化的出现。纯化的亚硝酸还原酶可分为两种：一种为具有细胞色素cd型的血红素蛋白，呈现细胞色素氧化酶活性，存在于粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）等中。另一种是含铜的金属黄素蛋白，存在于裂环无色杆菌（Achromobacter cyclolastes）等中。
（3）氧化亚氮还原酶（N2OR）
氧化亚氮还原酶定位于细菌细胞膜。在电子转移过程中有细胞色素b和c参与。酶相对分子质量为85kDa，不含有Mo和Fe，但含有Cu。Cu是反硝化细菌产碱菌在N2O下厌氧生长合成氧化亚氮还原酶的制约因子。乙炔、一氧化碳、叠氮、氰化物、氧和普通盐类都可抑制氧化亚氮还原酶的活性。
4.影响反硝化作用的一些因素
环境中的氧可以抑制氮氧化物还原酶的活性。关于氧的临界浓度，由于各研究者采用的方法、菌种等不同而不同。在还原酶中，各种酶对O2的抑制作用反应敏感性不一样。在硝酸还原过程中越在后面的还原酶，对氧越敏感，在同一O2浓度时，受抑制越严重。
厌氧环境中的反硝化活性与环境中的有机碳含量密切相关。加入外源性有机碳常可刺激反硝化作用，不同的有机碳化合物对反硝化过程中不同还原酶的影响不一样。在有机碳极为丰富的环境中加入外源碳对反硝化作用无多大影响，而且在这种环境中反硝化过程的终产物不是气态产物而是NH4＋。
气态氮氧化物（NO，N2）不影响离子型氮氧化物（NO3－，NO2－）的还原，但离子型氮氧化物的还原常优先于气态氮氧化物的还原，并造成反硝化中间产物的明显积累。如脱氮假单胞菌中，NO2－不影响NO3－的还原速率，但可部分抑制N2O的还原。
反硝化作用最适宜的pH是在7.0～8.0之间，而且反硝化速率与pH成正相关。在低pH值时，氮氧化物还原酶，尤其是还原N2O的氧化亚氮还原酶受到明显抑制，而使整个反硝化速率降低，N2O在产物中的比例增加，pH为4时N2O可能为主要产物。因此要降低整个反硝化速率可降低环境pH值或增加氧浓度。
反硝化作用在一定范围内随温度升高而速率提高，在10～35℃之间的Q10值为1.5～3.0，在60～75℃时速率达到最大值。超过这一范围，Q10值呈负值，速率急剧下降，而且此时产物中的N2O比例极高，可能是氧化亚氮还原酶较其他还原酶对高温更敏感。低温时反硝化作用显著降低，但即使在0～5℃时仍可检测到土壤中的反硝化产物。
5.反硝化作用的利用与控制
利用硝化作用和反硝化作用去除有机废水和高含量硝酸盐废水中的氮，来减少排入河流的氮污染和富营养化问题，已是环境学家的共识。利用各种反应器处理城市的或其他废水时，有机废水中的碳源可支持反硝化作用，进行有效的生物脱氮。
反硝化作用能造成氮肥的巨大损失。从全球估计，反硝化作用所损失的氮大约相当于生物和工业所固定的氮量。施用硝化抑制剂可收到良好的效果。
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