血管生成促进因子

研究发现多种血管生成促进因子，包括血管内皮细胞生长因子、血管生成素、成纤维细胞生长因子、血小板衍生的内皮细胞生长因子、Ephrins等，通过与特异性受体与相应的靶细胞相结合，促进血管内皮细胞的增殖等，诱导新生血管的形成，为肿瘤的生长和发展提供了有利条件。

一、血管内皮细胞生长因子

（一）血管内皮细胞生长因子及其受体

血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial cell growth factor，VEGF）是一种有生物学效应的血管源性肽，是作用较强的血管内皮生长因子之一，能够调整造血干细胞的发育、细胞外基质的重塑和炎性细胞因子的再生，在血管生成中起着中心调控作用。

VEGF最早发现于1983年，并于1989年被克隆。之后，又有多种与VEGF结构和功能类似的蛋白被发现，共同归于VEGF家族，包括VEGF-A（即常称的VEGF）、胎盘生长因子（placental growth factor，PLGF）、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D（也被称为c-Fos induced growth factor，FIGF）和VEGF-E。这些VEGF家族成员的功能主要由一组同源的酪氨酸激酶受体（VEGFR）所介导，包括VEGFR-1（又称作Flt-1）、VEGFR-2（又称作KDR/Flk-1）、VEGFR-3（又称作Flt-4）。其中，VEGFR-1和VEGFR-2分布于血管内皮细胞膜上，而VEGFR-3则主要定位在淋巴管内皮细胞膜上。VEGF家族各个成员通过与不同的受体相结合发挥其生物学作用，VEGF-A能够与VEGFR-2和VEGFR-1结合，VEGF-C和VEGF-D能够与VEGFR-2和VEGFR-3结合，而PLGF及VEGF-B仅能与VEGFR-1结合，VEGF-E仅能和VEGFR-2相结合，除此以外，部分VEGF家族成员的异构体还能与非酪氨酸激酶受体neuropilins（NRPs）相结合（图4-1）。

图4-1　VEGF类型及其相应受体

VEGF家族蛋白为分泌型蛋白，序列高度保守，其糖蛋白单体以二硫键结合形成同二聚体才具有生物学活性。VEGF家族各个成员的基因均含有7～8个高度保守的外显子，转录产生mRNA后，这些外显子经过不同的拼接方式能够形成多种转录本。如VEGF-A的8个外显子经过差异剪切能够产生至少8个不同的剪切体，编码不同氨基酸长度的蛋白质异构体，分别由121、145、165、183、189和206个氨基酸残基组成。它们具有相似的生物学活性，其中VEGF-A165是体内含量最为丰富、生物活性最强的异构体形式。

（二）血管内皮细胞生长因子与肿瘤血管生成

正常情况下，VEGF在成人各个组织脏器中的含量相对较低，但在某些生理及病理情况下，如在孕期卵巢黄体的发育、伤口愈合和组织修复以及新生血管形成过程（包括肿瘤血管形成）中，VEGF的表达会明显升高，并发挥其重要作用。多种细胞，包括大动脉的平滑肌细胞、角化细胞、巨噬细胞以及多种肿瘤细胞均能产生VEGF。作为肿瘤组织中脉管系统生成的开关，VEGF能够通过调节内皮细胞整合素、纤溶酶原激活因子、间质胶原酶等多种蛋白水解酶激活因子的表达，促进ECM的降解，使血管通透性明显增加，并通过与内皮细胞膜上的受体相结合，通过旁分泌机制诱导内皮细胞分裂、增殖、迁移，促进血管生成，同时，VEGF还能作为新生血管的凋亡抑制因子发挥促进血管生成的作用。

已经有大量文献报道，在多种肿瘤组织，包括肾癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、黑色素瘤以及胚胎组织性肿瘤中均发现有VEGF的过表达或功能的异常；而当肿瘤细胞中的VEGF通路被阻断后，发现肿瘤的血管生成被明显抑制。而且，VEGF的表达与多种肿瘤的分级分期和预后密切相关。研究显示，在乳腺癌、肺癌以及胃肠道肿瘤患者的外周血循环中能够检测到VEGF的量有明显升高，在肿瘤患者手术后标本中进行的检测表明与VEGF表达较低的患者相比，VEGF表达较高的患者预后较差，较早出现复发；此外，VEGF mRNA的水平还与宫颈癌、乳腺癌等恶性肿瘤的血管密度有关，这些结果提示VEGF可能作为一个分子标志物而广泛应用于多种肿瘤的诊断。

最近研究表明PLGF及其受体VEGFR-1在血管形成中起重要作用，对VEGF起协同作用，能够有效地促进缺血组织血管形成；VEGF-B单体可以和VEGF形成异源二聚体，能够控制VEGF与VEGFR-2的亲和力，具有加强VEGFR-2介导的血管形成作用；VEGF-C和VEGF-D的主要功能是刺激淋巴管的形成，但它们的水解产物可以和内皮细胞表面的VEGFR-2结合，促进血管形成；另外，VEGF-C还可以增加VEGFR-2高表达的微血管的通透性，等等。VEGF和VEGFR在肿瘤血管形成中的作用见图4-2。

（三）血管内皮生长因子的调控

VEGF的表达可以被多种因素调控，包括缺氧、癌基因/抑癌基因、多种生长因子和细胞因子。

肿瘤在其生长过程中，由于体积的迅速增大，很容易造成中心部位血流供应不足导致缺氧，而氧压力是调控VEGF基因表达的主要生理因素之一，在VEGF基因的非转录调控区含有缺氧反应增强子元件（hypoxiaresponsive enhancer elements，HREs）。在细胞缺氧情况下，缺氧诱导转录因子1（hypoxia-inducible transcription factor 1，HIF-1）会与HRE结合，诱导VEGF-A的表达。而且，在缺氧条件下，由于某些目前尚未确定的因子与VEGF-A mRNA的结合，会导致后者稳定性增加。VEGF-A的表达还受到众多生长因子和细胞因子的调控，如细胞血小板源生长因子B链的纯合二聚体（PDGF-BB），TGF-β，表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF），碱性成纤维生长因子（FGF-2、FGF-4），肿瘤坏死因子α（TNF-α），角化细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF），白介素-1β（IL-1β），以及IL-6等均能上调VEGF的表达。另外一些细胞因子，如IL-10和IL-13则能够抑制VEGF的释放，从而抑制其功能的发挥。

图4-2　VEGF和VEGFR在肿瘤血管形成中的作用

肿瘤细胞或宿主基质细胞分泌的VEGF配体刺激内皮细胞、淋巴内皮细胞或造血细胞表达VEGFR-1、VEGFR-2或VEGFR-3等。VEGF刺激VEGFR表达阳性内皮细胞的增殖、迁移和血管通透性等。VEGF-C和VEGF-D能够刺激VEGFR-3表达阳性的淋巴管内皮细胞增殖和淋巴管生成等。

癌基因信号通路的激活以及抑癌基因的失活均有可能导致肿瘤细胞中VEGF的过量表达。在多种肿瘤中发现有这样的现象，即在肿瘤边缘血供丰富，不存在缺氧问题的区域也能检测到高水平VEGF的表达。接着又发现，ras/MAPK信号通路中某些癌基因（如ras、raf等）的激活，也能够促进VEGF mRNA的转录表达。

vHL是一种在小脑成血管细胞瘤及肾癌等血管含量丰富的肿瘤中广泛存在突变失活的抑癌基因，而且，从这一类肿瘤中分离的细胞中发现有VEGF的过量表达，提示该基因可能与肿瘤血管生成相关。研究显示，vHL在转录及转录后水平对VEGF的表达进行调控：在转录水平方面，vHL可以和转录因子Sp1形成复合物。在VEGF基因的启动子区域含有Sp1特异性的结合位点，当vHL和Sp1结合后能够抑制后者转录活性及其所诱导的VEGF的表达。该Sp1结合位点对于PDGF所诱导的VEGF的表达同样很重要，当VEGF启动子区的Sp1结合位点发生突变导致不能与Sp1结合时，会抑制PDGF所诱导的VEGF的表达。而在转录后水平，vHL能够抑制蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）的活性。在vHL功能缺失的肿瘤细胞中，PKC活性增强，能够激活一些相对分子质量约为32　000、28　000、17　000的蛋白质，这些蛋白质可以和VEGF mRNA3′端非翻译区的一段长大约为500bp的区域结合，并使VEGF mRNA稳定性增加，从而促进VEGF的表达。p53是另一参与调控VEGF表达的抑癌基因。研究显示，野生型的p53能够抑制VEGF的表达，而突变失活的p53则能够加强VEGF的表达。

二、血管生成素

血管生成素（angiopoietin，Ang）是一种分泌型的血管生长因子，在血管生成过程中也发挥重要作用。Ang家族含4个成员，分别为Ang-1、Ang-2、Ang-3（鼠源）、Ang-4（人源），其中，以对Ang-1和Ang-2的研究较为深入。

Ang-1和Ang-2是可溶性的细胞因子，两者有60%的氨基酸同源性，主要由内皮细胞和周细胞产生，均能与细胞膜表面的Tie-2受体相结合。Ang-1与Tie-2受体结合后，通过诱导磷酸化而激活后者，并通过促进内皮细胞与支持细胞，如周细胞及平滑肌细胞等的相互作用，参与维持血管的稳定性。Ang-2同样也是通过与膜受体Tie-2结合发挥作用，与Ang-1不同的是，不使Tie-2磷酸化而激活Tie-2，反而拮抗Ang-1的生物活性，破坏血管完整性，影响内皮细胞之间及其与支持细胞之间的连接。因此，经过膜受体Tie-2的信号传导通路看来是取决于Ang-1以及Ang-2之间的平衡。研究者认为，Ang-1提供促进和维持成熟血管内皮细胞的稳定性和完整性的信号传导，但在血管的初始形成阶段作用并不显著；而由缺血等刺激因素诱导的Ang-2表达则能竞争抑制Ang-1的功能，导致血管的不稳定性，促进血管生长。

早期的动物实验结果显示，Ang-1以及Tie-2缺失的小鼠均导致胚胎死亡，并显示相似的原始血管形成障碍，包括血管形成差、分支少、血管重塑能力低、通透性高等。而Ang-1转基因小鼠则显示出皮肤血管的增生，另外，研究显示Ang-1还具有促进血管生成、抑制血管渗漏、诱导血管（尤其是微血管）扩张的作用。这些结果向我们提示，Ang-1在血管生成过程中确实起到非常重要的促进作用。但是，Ang-1本身并不具有促进DNA合成、诱导内皮细胞增殖和形成管腔样结构的作用，但其在VEGF、TNF-α等生长因子存在的条件下，由于其抗凋亡、促内皮细胞迁移的功能，与这些生长因子协同作用，促进血管网络的形成。在大部分实验体系中，Ang-1是促进肿瘤血管生成和肿瘤生长的；虽然，Ang-1并不是大部分恶性肿瘤普遍表达的分子，但在部分骨髓瘤、肝癌、结肠癌、黑色素瘤患者中发现有该因子的高表达现象。

Hatanaka的研究显示，肿瘤产生的IL-10通过Ang-1、Ang-2和Tie-2的表达，促进间质血管形成。Ang-Tie-2信号通路，尤其是Ang-2在多种肿瘤（包括前列腺癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、肺癌等）的血管形成中起到重要作用。在肿瘤发生的早期，Ang-2参与破坏瘤体周边原有的正常血管，而促进肿瘤新生血管的生成，在瘤体周边形成所谓的血管共择（co-option）区。当肿瘤形成以后，Ang-2与血管内皮生长因子（VEGF）有协同作用，共同促进肿瘤血管生成，并阻碍血管的完整性，使得肿瘤新生血管能在各种因子的刺激下不断增生。免疫组化检测显示在肿瘤发生的早期即可检测到Ang-2，并位于肿瘤血管生成和侵袭的最前沿，是肿瘤生长最早期的标志物之一，现在已经证实，在多种恶性肿瘤的早期患者血清中都可检测到Ang-2的增高。另外，Ang-2的表达与恶性肿瘤的分级分期以及血管侵犯等过程密切相关。

三、成纤维细胞生长因子

成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）最初是因为其对成纤维细胞具有很强的增殖作用而得名。现在已经发现该家族有20余个成员，分别命名为FGF1至FGF23，各成员间具有一定的序列同源性和结构相似性。其中发现最早和研究最多的是FGF1（即酸性FGF，aFGF）和FGF2（即碱性FGF，bFGF）。

FGFs与存在于细胞表面的FGF受体（FGFRs）结合，将信号传递到胞内。目前已经发现FGFRs有4种基因型（FGFR1～FGFR4），分别由独立基因编码，均为跨膜蛋白质，主要由胞外段、跨膜区和胞内段3个部分组成，广泛分布于FGF的靶细胞，如血管内皮细胞、成纤维细胞、淋巴细胞等。受体胞外段为配体结合区，包括2个或3个免疫球蛋白样功能区。FGFRs均为酪氨酸激酶型受体，在与配体结合后发生二聚体化，从而激活酪氨酸激酶，激活SHC/FRS（Src homology 2domain containing transforming protein/FGF receptor substrate 2）-Raf/MAPKKK-MAPKK-MAPK通路，向细胞内传递信号。

aFGF具有广泛的生物学功能，在组织生长发育和修复、血管生成、内皮及间质细胞的增殖以及肿瘤发生等过程中均发挥重要作用。在目前已知的FGFRs中，aFGF可与高亲和性的FGFR4结合。研究发现，一些癌基因产物与aFGF同源，某些恶性肿瘤（如胶质瘤、黑色素瘤、横纹肌肉瘤细胞等）可自分泌aFGF，促进肿瘤生长，并与其他因子协同作用导致新生血管壁的高通透性，推测肿瘤组织中血管生长活跃、细胞破坏可能与aFGF有关。

研究表明，在胰腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤组织中，aFGF以及bFGF尚有mRNA水平的高表达，而且，bFGF较aFGF上升更为明显；不仅如此，在恶性进展程度高的肿瘤中，两者的表达水平比恶性程度低的肿瘤和交界性肿瘤更高，说明aFGF和bFGF在促进肿瘤进展过程中起到非常重要的作用。

就生物活性来说，bFGF比aFGF作用更强。bFGF主要通过与细胞膜上的高亲和力受体FGFRs结合发挥其生物学作用；但其发挥作用还离不开低亲和力受体，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heprin sulfate proteoglycans，HPG）的辅助，HPG具有促进bFGF与FGFR结合、增强bFGF稳定性、调节bFGF活性等生物学作用。多种肿瘤细胞存在bFGFR的高表达现象，不仅如此，有的肿瘤细胞（如神经胶质瘤、横纹肌肉瘤、白血病、肺癌、黑色素瘤、肝癌等）既表达bFGF，又表达bFGFR，bFGF可通过自分泌和/或旁分泌作用直接刺激肿瘤细胞。恶性肿瘤细胞与正常细胞的本质区别之一在于肿瘤细胞的自主性生长，因此bFGF的促增殖能力在这个过程中可能起到重要作用。目前认为，除bFGF对肿瘤细胞的促增殖作用，其促肿瘤血管生成作用在肿瘤的发生发展中亦起着重要作用，并可能是bFGF参与肿瘤病理过程的主要途径，具有更重要的意义。研究发现，bFGF几乎参与了血管生成全过程，包括刺激血管内皮细胞产生胶原酶和纤维溶解酶原激活蛋白，使血管基底膜降解；刺激内皮细胞迁移；诱导血管内皮细胞增殖并形成类似管腔的结构；促进肿瘤或血管内皮细胞表达VEGF及其受体，并与VEGF协同作用，诱导血管生成（图4-3）。

图4-3　FGF-2在肿瘤中的作用

肿瘤细胞生成的FGF-2能够刺激间质和血管内皮细胞产生细胞因子等，刺激血管内皮细胞的增殖和血管形成等。

四、血小板衍生的内皮细胞生长因子

血小板衍生的内皮细胞生长因子（platelet-derived endothelial cell growth factor，PD-ECGF），是从人类血小板中分离提取的一种血管生成因子，又因其能可逆催化胸腺嘧啶核苷为胸腺嘧啶和2-脱氧-核糖-1-磷酸，后者去磷酸化的产物2-脱氧-D-核糖具有血管生成和催化内皮细胞活性作用，被称为胸苷磷酸化酶。PD-ECGF本身并不直接激活内皮细胞的增殖生长，但其在体外对内皮细胞具有趋化活性，可刺激内皮细胞有丝分裂和DNA合成，而在体内研究中发现其具有血管生成活性，可促进血管的发生和生长。PD-ECGF是少有的具有酶活性的促血管生长因子，主要分布于人体血小板和胎盘，在宫颈癌、肝癌、胃癌、大肠癌等许多实体瘤中异常增高，其表达增高与恶性肿瘤的转移呈正相关关系，并往往预示其预后不良，容易复发；PD-ECGF与宫颈癌、食管癌、胃癌、肝癌等肿瘤组织中微血管密度密切相关，甚至可使肿瘤细胞的凋亡减少；在宫颈癌、卵巢癌、肝癌、结直肠癌等恶性肿瘤患者的血浆中还发现有PD-ECGF的水平较正常组织，或者是肿瘤晚期患者血浆中PD-ECGF水平较早期患者增高的现象。这些结果提示，PD-ECGF水平，尤其是血浆PD-ECGF的水平将可能成为许多实体瘤的发生、发展及预后的评判指标。

多种细胞因子（如TNF-α、IL-1、IFN-γ）等和一些化疗药物（如环磷酰胺、丝裂霉素C）以及X线辐射等均能诱导PD-ECGF的表达。PD-ECGF的具体调控机制目前还不是很清楚，但研究显示，该基因的启动子区域含有数个Sp1转录因子结合位点，有可能是其基础表达和TNF-α诱导表达的基础。

五、基质金属蛋白酶（MMPs）

在前面的章节中，我们对MMPs通过降解ECM促进肿瘤的侵袭、转移进行了阐述，在本节中将着重介绍MMPs在肿瘤血管生成中起到的作用。

正如前面所提到的，新生血管在芽生过程中必须降解局部ECM成分，而MMPs在此过程中起到非常重要的作用。但是因为MMP各个成员间生物活性上的交叉，大部分MMPs基因敲除的小鼠并不显示明显的血管生成障碍，仅MT1-MMP敲除小鼠显示有血管生成缺陷。

MMPs对内皮细胞本身就有多方面的作用，其对于内皮细胞的迁移和管腔形成是必要的。MMPs能够帮助肿瘤细胞突破纤维蛋白屏障进行侵袭和转移，其中MT1-MMP显示出较其他成员更强的纤维蛋白溶解能力。MMP-7具有增强内皮细胞增殖、上调内皮细胞表达MMP-1和MMP-2的能力，并在体内诱导血管生成。MMPs还能剪切内皮细胞Cadherin的细胞外结构域，破坏细胞间连接，促进肿瘤细胞的转移。

MMPs可以由多种细胞产生，如渗透的炎性细胞、肿瘤细胞以及血管内皮细胞本身；多种血管生成促进因子可以诱导内皮细胞表达MMPs。研究发现，在血管内皮细胞的胞膜上的小泡中有MMP-2、MMP-9、MT1-MMP等，而且，bFGF和VEGF能够促进这些小泡的脱落，导致MMPs释放并发挥其生物学功能。bFGF可以通过转录因子AP-1诱导内皮细胞表达MMP-9，另外，bFGF还可以刺激内皮细胞表达uPA以及整合素αvβ3，后两者分别具有激活MMPs级联和促使MMPs膜定位的功能。VEGF可以诱导内皮细胞表达MMP-1。此外，如炎性细胞释放的NO可以诱导内皮细胞中MMP-13的表达和激活，Ang1可以诱导内皮细胞分泌血浆纤维蛋白溶酶和MMP-2，并抑制其分泌TIMP-2等。而且，肿瘤细胞能够通过旁分泌细胞因子和生长因子诱导间质细胞表达MMPs。

多种血管生成促进因子能够诱导内皮细胞及间质细胞表达MMP，MMPs也能够增强其他血管生成促进因子的生物活性。如MMPs降解ECM可以促使后者释放其所结合的血管生成促进因子，包括VEGF、bFGF、TGFα等；MMP-2、MMP-3和MMP-7可以降解ECM中的核心蛋白聚糖释放潜在性TGF 1（无活性形式），而MMP-2和MMP-9则能剪切后者形成活性TGFβ1，发挥其生物学功能。

在肿瘤血管形成过程中，MMP-2和MMP-9对于肿瘤起始血管的形成起到“开关”的作用，在血管形成的肿瘤中，MMP-2和MMP-9的表达比无血管的肿瘤组织中明显增高。几乎在所有肿瘤组织中均有MMPs的过量表达，尤其是由肿瘤细胞本身、间质成纤维细胞或者是浸润的炎性细胞所产生的MMPs与肿瘤的侵袭和转移能力密切相关，并且预示着较差的预后。肿瘤组织中MMPs，尤其是MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-13的高表达与肿瘤的侵袭、转移能力和复发高风险密切相关。

血管生成拟态（vasculogenic mimicry）是近两年来提出的一种全新的肿瘤内血管生成模式，其特点为：肿瘤细胞表现出内皮细胞的行为，表达内皮细胞相关基因，并通过自身变形和基质重塑在肿瘤中产生血管样通道，通道内无内皮细胞衬覆，该血管样通道生成机制、管壁结构等都与传统的肿瘤内血管生成不一样。在应用黑色素瘤作为研究对象的体系中发现，MMPs在这一过程中也发挥了重要作用，如MMP-2、MT1-MMP以及层粘连蛋白5γ2等。在此过程中，磷酸肌醇3-激酶PI3K诱导MT1-MMP表达上调，后者能够调控MMP-2的活性、剪切层粘连蛋白5γ2成促转移片段。

并不是所有MMP家族成员均具有促进血管生成的作用，如有研究报道MMP-12能够剪切uPAR并释放uPA结合结构域，后者能够与uPA特异性结合并减弱uPAR的信号传导，抑制血管形成；MMP-3、MMP-9、MMP-12、MMP-13和MMP-20能够水解ECM成分，释放内皮抑素，后者则通过与内皮细胞表面的蛋白聚糖、VEGFR-2、整合素α5β1结合，抑制VEGF以及bFGF诱导的内皮细胞迁移，并诱导细胞凋亡。此外，血管生成抑制因子血小板反应蛋白也能够上调MMP的表达和活性。这些结果提示，MMPs对血管生成的调控是多方面的，这也需要进一步的研究来证实其中的具体机制。

六、其　他

已知的其他内源性血管生成促进因子还有很多，如肝素结合样多肽生长因子类：肝细胞生长因子HCG、血小板衍生生长因子PDGF等；非肝素结合样多肽生长因子类：转化生长因子TNF-α、TNF-β、表皮生长因子EGF、胰岛素样生长因子IGF等；炎性介质分子类：肿瘤坏死因子TNF-α、IL-8、IL-3、IL-1等；蛋白酶类：血管生成素angiogenin、环氧化酶COX-2、一氧化氮合酶；激素类：雌激素等；造血因子类：促红细胞生成素、粒细胞集落刺激生长因子等。它们对肿瘤中血管的生成有直接或者间接的促进作用。