血管生成抑制因子

一、血管抑素

血管抑素（angiostatin）是一种特异性抑制新生血管内皮细胞增殖和迁移的内源性血管生成抑制因子，它对肿瘤细胞和其他非血管内皮细胞无作用。血管抑素是纤维蛋白溶酶原的蛋白质水解片段，包含纤维蛋白的3（1～3）或4个kringles环状结构，其中kringles1～3对于抑制血管生成是必需的，由肿瘤细胞和巨噬细胞分泌的蛋白酶将纤维蛋白溶酶原裂解后产生。正常成人的血管内皮细胞（除了经期妇女子宫和创伤愈合）只有0.01%进行细胞分裂，而肿瘤病灶中进行细胞分裂的血管内皮细胞可达到正常的100～1　000倍，因此血管抑素通过作用于肿瘤血管内皮细胞，抑制内皮细胞增生、促进内皮细胞凋亡、抑制内皮细胞定向迁移和抑制毛细血管芽生等抗肿瘤血管生长活性；而且由于血管抑素是作用于增殖旺盛的血管内皮细胞，对正常组织血管内皮细胞的损伤很小，是一种高效低毒肿瘤血管抑制剂。

目前在内皮细胞膜表面发现了3种血管抑素的受体，包括ATP合酶、血管抑素、整合素αvβ3。血管抑素抑制血管生成的作用主要是通过细胞表面的相应受体来传导。

血管抑素抗肿瘤血管生长的可能作用机制包括：①增强黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）的活性，诱导内皮细胞凋亡。②拮抗bFGF和VEGF的作用，抑制血管内皮细胞的迁移和毛细血管芽生。③诱导促进细胞有丝分裂的蛋白激酶ERK-1和ERK-2脱磷酰化，使两种酶的活性明显降低，从而抑制内皮细胞的增生。④机体内组织纤维蛋白溶酶原激活物（tPA）通过与纤溶酶原细胞外基质结合形成三联体，以发挥其降解纤溶酶原的作用。血管抑素可以和tPA非竞争性结合，减少三联体生成，降低tPA的作用，减少纤溶酶生成，从而抑制血管内皮细胞的迁移和毛细血管芽生。⑤血管抑素可以通过和内皮细胞表面ATP合成酶的α/β亚基结合，使内皮细胞在缺氧环境中合成ATP的能力丧失，抑制内皮细胞增生。

二、内皮抑素

内皮抑素（endostatin）是由内皮细胞产生的小分子蛋白，是Ⅹ型、Ⅷ型胶原蛋白的C末端片段，其抑制血管内皮细胞生长的作用比血管抑素更强，也是迄今为止已知的活性最强的肿瘤血管生成抑制因子。内皮抑素的作用依赖于锌离子，它所含的锌与蛋白分子比为1∶1。内皮抑素特异性地作用于内皮细胞，尤其是微血管的内皮细胞，抑制其迁移，诱导凋亡，从而抑制新生血管形成、抑制肿瘤生长和转移。

内皮抑素的发现者O’Reilly等将体外重组内皮抑素通过皮下注射到小鼠体内，能够有效地抑制小鼠肺癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、血管内瘤等的生长和发展，而且抑瘤效果与注射剂量相关；继续注射可使肿瘤细胞处于休眠状态。在鸡胚绒毛尿囊膜实验中，发现内皮抑素对血管生长抑制率达60%，但对静止的血管内皮细胞无明显作用。

一般认为内皮抑素可直接与血管内皮细胞受体结合，特异性地抑制内皮细胞的增殖，其机制可能与内皮细胞凋亡的增加或细胞周期的改变有关，而不是直接作用于肿瘤细胞的生长，因为在内皮抑素作用下肿瘤细胞的增殖并不受影响。内皮抑素可抑制VEGF等血管生长因子，从而抑制内皮细胞的增殖与肿瘤的生长；可抑制Cyclin D1的表达，改变细胞周期；可抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x1，促使血管内皮细胞凋亡加速。Dhanabal等通过实验发现，内皮抑素能使Bcl-2和Bcl-x1显著减少，同时不影响Bax水平，这样大量Bax二聚体形成并诱导内皮细胞凋亡。内皮抑素通过抑制肿瘤血管的生长，能够导致肿瘤缺氧，再加上其他可能的间接细胞毒作用，从而使肿瘤细胞坏死、凋亡，使肿瘤收缩。

内皮抑素的生物学功能也可能是通过直接或间接改变其他与生长相关分子的功能而实现的。如内皮抑素与其他血管形成刺激因子（例如bFGF等）竞争肝素或硫酸乙酰肝素亲和位点，抑制血管生成。研究发现，用去除了肝素亲和性的内皮抑素对bFGF介导的血管生成无抑制作用，这说明内皮抑素的肝素亲和性有重要的生物学功能。

临床研究表明该药物在肿瘤模型中能抑制65种不同肿瘤的生长，促进细胞凋亡，无宿主毒性，且不易产生抗药性。由于内皮抑素的这些特性，使其有可能成为新的抗肿瘤药物，但其作用机制尚需深入研究。由于内皮抑素在抗肿瘤血管治疗中展现的广阔前景，1999年在美国已经进入Ⅰ期临床，内皮抑素在实验的各种剂量下，均对患者无任何毒副作用。现在准备进入Ⅱ期临床，进一步验证其对肿瘤的确切疗效。

内皮抑素在体外不稳定，需长期、大剂量用药，且重组内皮抑素生产过程复杂、造价昂贵，所以内皮抑素的治疗应用受到限制。而利用载体将内皮抑素基因导入体内，通过在体内表达内皮抑素来发挥抗癌功效，则有可能克服以上困难。目前用于基因治疗实验的内皮抑素基因载体有质粒、脂质体、腺病毒、腺病毒相关基因、逆转录病毒等。用基因表达载体将内皮抑素转至荷瘤小鼠体内，实验结果表明，内皮抑素的表达可有效抑制包括肺癌、乳腺癌等肿瘤的生长及转移。但这种方法在人体使用的可靠性还有待进一步研究。

三、血小板反应蛋白

血小板反应蛋白（thrombospondin，TSP）是一种糖蛋白。最初对该蛋白的解释是凝血酶激活血小板释放的一种产物。多种细胞，包括成纤维细胞、血管平滑肌细胞、单核细胞、巨噬细胞以及肿瘤细胞等，均能合成分泌TSP。TSP属于细胞外蛋白，该家族有5个成员，分别是TSP-1、TSP-2、TSP-3、TSP-4、TSP-5，其中TSP-1和TSP-2具有抑制血管形成的作用。

TSP-1是最早发现的TSP家族成员，目前对其的研究相对较多，也较为清楚。TSP-1能够通过诱导内皮细胞凋亡和抑制内皮细胞迁移，从而抑制血管生成。研究显示，TSP-1主要是通过与内皮细胞膜表面的受体CD36结合，并通过包含JNK-1、p38MAPK、caspase3等在内的多条信号传导通路抑制细胞凋亡。除此以外，TSP-1尚能抑制VEGF所诱导的Bcl-2的上调，进而间接抑制内皮细胞的存活。TSP-1能与某些生长因子（如FGF-2等）竞争性结合在内皮细胞膜上的蛋白聚糖辅助受体，抑制这些生长因子的促血管生成作用。

研究者发现，多种体外培养的人类肿瘤细胞均能合成并分泌TSP-1，如鳞癌细胞、黑色素瘤细胞、胶质瘤细胞、骨肉瘤细胞以及乳腺癌细胞等，但这些转化细胞所产生的TSP-1的量比相对应的正常细胞要低得多，如转移性乳腺癌细胞产生的TSP-1为正常乳腺细胞产生的量的1/3。而且，在对胆囊癌及膀胱癌进行的研究显示，TSP-1表达较低的患者淋巴结转移和静脉侵犯率较高，术后更容易复发，术后总体生存率也比TSP-1表达较高的患者明显降低。

总体而言，在多种癌基因或抑癌基因突变的肿瘤中，TSP-1的表达水平是降低的。有研究表明，在hRas、jun、myc、vScr等癌基因功能激活以及抑癌基因p53功能失活的多种肿瘤中，均检测到TSP-1的表达有所降低。在这些研究中，TSP-1表达的下降通常伴随着血管密度下降，这也意味着血管生成的减少。这表明，这些癌基因或抑癌基因产物可以通过直接或间接的方式参与TSP-1表达的调控，从而影响肿瘤血管的生成。

TSP-2与TSP-1DNA序列高度同源，在平滑肌细胞及纤维母细胞等细胞中表达。Kyriakides等建立了TSP-2基因缺失的小鼠模型，发现该模型表现出皮肤变脆、皮肤及其他组织小血管密度增加、出血时间延长等表型，提示TSP-2与调节细胞表面功能、影响细胞的黏附和移动以及小血管的形成有关。用TSP-2转染人类恶性肿瘤细胞后进行的致瘤实验显示，即使是在肿瘤细胞高度表达VEGF等血管生成因子的情况下，TSP-2仍能有效抑制肿瘤中血管的形成，并促进肿瘤的坏死，说明TSP-2是一种有效的内源性肿瘤生长和血管生成抑制物。进一步的研究显示，TSP-2能够抑制血管内皮细胞的增殖分化，以Caspase-3依赖的方式促进内皮细胞的凋亡，并能够抑制微血管内皮DNA的合成，抑制新生微血管的形成。此外，还有研究报道，TSP-2还能下调MMP-2和MMP-9的表达，抑制肿瘤血管的形成和细胞的转移。在多种临床肿瘤，如结肠癌、卵巢癌、唾液腺癌等的研究中发现，TSP-2表达阳性肿瘤的血管密度要低于TSP-2表达阴性的肿瘤，并提示相对较好的预后。

四、肿瘤抑素

肿瘤抑素（tumstatin）是一种内源性的血管生成抑制因子。Ⅳ型胶原蛋白是血管基膜的主要成分，由6个独特的基因产物α₁～α₆来编码，并以不同或相同的α链组成三聚体，进一步形成网状结构，为其他的生物大分子提供一个蛋白质支架。Ⅳ型胶原的每条α链都由三部分组成，即N端的7S域、分子中间部分的三股螺旋胶原域和C端球状非胶原域1（NC1）。肿瘤抑素是包括Ⅳ型胶原蛋白α3链的NC1活性区域的232个氨基酸和中间3股螺旋区C端的12个氨基酸的一个相对分子质量为28　000的蛋白。

迄今为止，研究者们应用重组人源蛋白对肿瘤抑素的活性进行大量探索，发现其具有2个不同的活性区，其功能是通过与内皮细胞膜上的αvβ3整合素受体特异性结合来实现的。Maeshima等人通过缺失突变的方法证明肿瘤抑素的抗肿瘤新生血管生成活性位于被称为T7片断的74～98位氨基酸，它具有与全长肿瘤抑素相同的抗血管生成活性，能够明显抑制前列腺癌移植瘤的血管形成和肿瘤生长，而且在以内皮抑素为对照的试验中发现，相同剂量的肿瘤抑素对小鼠前列腺癌移植瘤的控制较内皮抑素有效率高约9倍。另外，人工合成的肿瘤抑素的第185～203位的氨基酸片段能特异性地与CD47/αvβ3受体结合，促进多种癌细胞黏附和趋化作用以及抑制肿瘤细胞的增殖。在小鼠黑色素瘤模型中证明内皮抑素185～203位的氨基酸组成的19肽能以构象依赖方式抑制小鼠体内肿瘤的生长，19肽的这种活性是通过下调基质金属蛋白酶（MMP）和血纤维蛋白溶酶原来实现的，抑制了肿瘤细胞的增殖，减少了细胞的浸润性；但其对内皮细胞却没有这样的作用。

肿瘤抑素的两个结合位点都是以RGD（Arg-Gly-Asp）基序非依赖性方式特异性地与受体αvβ3结合的。肿瘤抑素在功能上作为肿瘤病理新生血管生成的抑制剂，但对生理新生血管生成却没有什么影响，因为这两种新生血管在表达β整合素上有不同。Hamano等人的试验证实在增生肿瘤中的血管和毛细血管上有40%表达αvβ3整合素，在每个细胞上，可以有多达几万个αvβ3受体，然而在愈合的皮肤伤口和再生肝脏的血管中没有发现αvβ3整合素的存在，正是这些αvβ3整合素表达量的显著差异，导致了肿瘤抑素抑制新生血管生成作用的明显不同。肿瘤抑素与整合素的结合，可中断内皮细胞与基膜之间的信息联系，引起内皮细胞的凋亡、基膜降解，从而破坏内皮细胞的迁移、增生和存活。这种生物活性对于抑制新生血管生成和肿瘤细胞的生长具有重要的意义。

研究表明，肿瘤抑素与整合素αvβ3相互作用，抑制FAK（focal adhesion kinase）、PI3K（phosphatidylinositol 3-kinase）、PKB（protein kinase B）/Akt和mTOR（mammalian target of rapamycin）的活性，从而通过抑制真核起始因子4E的磷酸化，导致在翻译的过程中，真核起始因子4E无法与4E结合蛋白1分离，造成帽子依赖型蛋白的合成受到抑制，这些结果提示肿瘤抑素通过与αvβ3整合素的相互作用，选择性抑制了内皮细胞蛋白合成，抑制细胞增殖。另外，肿瘤抑素诱导增殖的内皮细胞凋亡，与上调的caspase3相关。

MMPs是一类肿瘤新生血管生长的正调控因子，近来研究发现MMPs对肿瘤血管生成也存在负调控作用，能降解基膜并生成具有抗血管生成活性的蛋白片断，例如血管抑素、内皮抑素和肿瘤抑素等。MMP-9是效率最高的从Ⅳ型胶原蛋白切割下肿瘤抑素片断的酶，MMP-2、MMP-3和MMP-13也能释放出肿瘤抑素，但是效率不如MMP-9。可见，MMP-9可能参与肿瘤血管形成的双向调控，在早期可促进血管的生成，引起基膜的破坏、内皮细胞的迁移，导致了肿瘤生长的起始；同时，通过生成肿瘤抑素等内源性蛋白片断来抑制肿瘤的生长。

肿瘤抑素由于其用于肿瘤治疗时具有针对肿瘤血管的高特异性，而且副作用小，不易产生耐药性而成为极有潜力的抗肿瘤药物。但因为对肿瘤抑素在生理水平的作用还不是完全清楚，故而对其作用机制和活性的进一步研究将有助于其在临床的早日应用。