肺癌转移的分子生物学基础

组织侵袭及转移是多数恶性肿瘤的普遍特征，肿瘤细胞需要失去和相邻细胞的黏附接触，这样细胞才可以侵入周围区域，进入血液循环，从脉管中移出进入靶器官，最后异位生长成为新的转移瘤。

一、细胞黏附及细胞外基质因素与肺癌的转移

E-钙黏蛋白-环连蛋白（E-cadherin-catenin）复合体对细胞黏附及维持正常组织和恶性组织的结构至关重要，此复合体中一个或多个组分表达的降低或改变均会增加肿瘤细胞的侵袭及进展行为，使肿瘤的预后变坏。最近，有研究发现肺癌细胞钙黏蛋白复合体表达的降低与肿瘤细胞的去分化、侵袭性增加、转移及不良预后等有关。

细胞-细胞及细胞-基质黏附涉及4组细胞间黏附分子（CAMs），其中钙黏蛋白被认为是最为重要的细胞黏附分子之一，钙黏蛋白是一种单个的跨膜蛋白，以严格的钙依赖方式介导细胞-细胞间的黏附。其他的CAMs有整合素、免疫球蛋白超家族及选择素等。根据组织分布，CAMs可以分为10个以上的亚组，其中包括E-（上皮）钙黏蛋白、N-（神经）钙黏蛋白以及P-（胎盘）钙黏蛋白等。E-钙黏蛋白局限于源于外胚层、中胚层及内胚层组织的上皮细胞，是上皮细胞间黏附连接的关键组分，也是研究最多的黏蛋白之一。

细胞外E-钙黏蛋白介导的细胞-细胞间黏附功能要起作用，需要一系列复杂的E-钙黏蛋白和一组胞浆内称为环连蛋白（catenin）的分子之间交互作用。环连蛋白将钙黏蛋白的胞内域与细胞骨架的肌动蛋白相连接，这种连接对构成坚固的细胞间黏附是非常必要的。环连蛋白包括α-环连蛋白、β-环连蛋白、γ-环连蛋白及一种独特的环连蛋白p120。

要保证整个的E-钙黏蛋白复合体的功能完整，E-钙黏蛋白以及每个环连蛋白的表达及功能正常是非常关键的。E-钙黏蛋白-环连蛋白复合体的磷酸化会导致其功能失活，尽管有充足的E-钙黏蛋白或环连蛋白，如果出现β-环连蛋白或γ-环连蛋白的酪氨酸磷酸化，将会导致黏附复合体的解离，随后导致肿瘤细胞的侵袭性增加。这种磷酸化过程可以被肝细胞生长因子（HGF）或表皮生长因子（EGF）所触发。EGFR与β-环连蛋白的核心区域相互作用，EGFR具有酪氨酸激酶活性，当与EGF结合后会自身激活，通过这种机制，配体与EGFR结合后会立即导致β-环连蛋白和γ-环连蛋白的磷酸化。有趣的是，Erb-B2过表达所介导的E-钙黏蛋白表达的降低可以被阻断Erb-B2受体磷酸化的抗体所恢复。

有人认为，E-钙黏蛋白是一种抑制细胞侵袭的因子，环连蛋白分子的精细平衡对维持正常细胞功能也是必不可少的。E-钙黏蛋白的生长抑制功能是通过上调细胞周期蛋白依赖性激酶从而引起细胞周期阻滞完成的。Gagliardi及其同事发现从正常黏膜到腺瘤，从原发癌到转移性病变，E-钙黏蛋白的表达逐步下降，提示了E-钙黏蛋白在肿瘤的发展过程中具有关键的地位。Perl应用转基因胰腺B细胞肿瘤形成模型发现，E-钙黏蛋白介导的细胞间黏附功能的丢失是腺瘤转化为侵袭性癌的原因，将正常的E-钙黏蛋白基因转染到肿瘤细胞，这些细胞将丧失其侵袭能力，反之，应用抗E-钙黏蛋白抗体可以引起正常细胞的侵袭行为。这说明E-钙黏蛋白-环连蛋白复合体的功能紊乱是肿瘤去分化和侵袭的原因而不是肿瘤去分化和侵袭的后果。

E-钙黏蛋白-环连蛋白黏附复合体与肺癌的病理、分期和生存密切相关。在分化良好的支气管肺泡细胞癌中E-钙黏蛋白及环连蛋白的表达水平非常高，而在未分化大细胞癌中其表达水平很低。在几个有关非小细胞肺癌的研究中，E-钙黏蛋白以及环连蛋白的表达与恶性细胞的分化程度明显相关，低表达提示肿瘤细胞的去分化。有数据显示迅速蔓延的侵袭性肿瘤E-钙黏蛋白-环连蛋白的功能受损或缺失。在非小细胞肺癌中，E-钙黏蛋白、α-环连蛋白、β-环连蛋白、γ-环连蛋白及p120表达的降低均与局部浸润的增加相关，并且与肺癌隐性淋巴结的转移存在明显的相关性。E-钙黏蛋白/环连蛋白的低表达与非小细胞肺癌的不良预后相关，应用免疫组化检查低表达的E-钙黏蛋白/环连蛋白有可能发现高危隐性淋巴结转移的非小细胞肺癌，此组患者或许能够从更为积极的治疗中获益。

整合素是一种细胞外受体，介导细胞与细胞外基质蛋白及其他细胞的黏附，在调控细胞增殖及迁移中都起着重要的作用。整合素可以对细胞内传出的信息产生反应，快速地改变其与配体的亲和力，其与配体的结合又可以激活细胞内的信号，调控重要的细胞功能，如增殖、凋亡及细胞迁移。细胞黏附及分离的调控对于肿瘤的迁徙与转移至关重要，小细胞肺癌的整合素以低活性状态存在，这有可能与其高转移性有关。

基质金属蛋白酶（MMP）是一种内肽酶，在生理状态下可以消化细胞外基质及基底膜成分，积极地参与肿瘤转移的过程。基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP）是特异性的内生MMP抑制物，TIMP1和TIMP2过表达可以导致细胞移动及侵袭的降低，TIMP1的下调可以增加其侵袭性。在小细胞肺癌中，两者的表达都升高，它们在小细胞肺癌侵袭、转移中的作用不明。

周清华等应用转nm23H1基因的人高转移大细胞肺癌细胞株L9981-nm23H1研究了nm23H1基因抑制肺癌转移的分子机制，nm23H1抑制肺癌转移与其上调E-钙黏蛋白、β-环连蛋白、TIMP-1的表达同时下调MMP-2、VEGF等的表达有关。进一步的临床免疫组化研究也发现，nm23基因、E-钙黏蛋白、β-环连蛋白在肺癌组织中表达水平（分别为53.0%、53.1%和47.2%）显著低于癌旁肺组织中的表达水平（分别为64.8%、79.7%和80.6%）和肺良性病变组织中的表达水平（分别为76.9%、83.5%和85.6%，P＜0.01）；有淋巴结转移的肺癌组织中的表达水平明显较没有淋巴结转移的肺癌组织低（分别为48.0%、47.3%、41.8%和65.0%、60.5%、60.3%，P＜0.01）；nm23基因、E-钙黏蛋白、β-环连蛋白低表达患者的5年生存率分别为3.6%、6.8%和3.8%，均远远低于高表达患者的39.3%、35.8%和37.3%（P＜0.01）。这从另一个方面说明了细胞黏附及细胞外基质因素在肺癌转移发生过程中起着重要的作用，nm23H1基因的表达与E-钙黏蛋白、β-环连蛋白明显相关，且它们的表达水平都与肺癌的进展和预后明显相关。

二、趋化因子CXC与肺癌的转移

趋化因子CXC是一种肝素结合蛋白，在血管生成的调控中具有独特的作用。一二十年来，研究显示趋化因子CXC及其受体可以直接增强或抑制和肿瘤相关的血管生成过程，与肿瘤相关免疫的调控相关，并能促进恶性肿瘤的器官特异性转移。肿瘤的转化、增殖、侵袭及转移都有赖于血管生成环境的建立，局部微环境的血管生成是由于促血管生成因素的表达超过血管生成抑制因素的表达所致。

在CXC趋化因子家族中，含有ELR基序的因子（ELR＋）是血管生成因子（包括CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7和CXCL8），缺乏ELR基序的因子（ELR-）为干扰素诱导产生的血管生成抑制因子（包括CXCL4、CXCL9、CXCL10、CXCL11）。根据结构和功能，CXC趋化因子家族经由不同的方式促进或者抑制血管生成过程，这种血管生成过程对肺癌非常重要。例如，内皮细胞VEGF的激活上调抗凋亡分子BCL-2，这又与内皮细胞CXCL8的表达相关，CXCL8以自分泌及旁分泌方式维持内皮细胞的血管生成表型。另外，还有其他的途径可以启动CXC趋化因子介导的血管生成过程，例如EGF和HGF诱导的信号转导通路的激活可以导致癌细胞中CXCL8的表达以及相应的肿瘤相关血管生成。这些结果显示在细胞内存在一种独特的旁分泌和自分泌连续转导通路，此通路可以增进肿瘤内微血管的密度及其存活，并且促进和ELR＋CXC趋化因子相关肿瘤的生长。

CXCL12是ELR-趋化因子，据报道通过CXCR4参与了血管生成的调控。但在最近一个人源非小细胞肺癌肿瘤原位及异位生长和转移模型中，CXCR4主要在肿瘤细胞表达，而与血管生成无关。在此活体模型中，如果肿瘤生成及转移过程中CXCL12被去除，原发肿瘤的大小没有变化，也没有任何证据显示原发肿瘤相关的血管生成的减少，但是，CXCL12被去除后的肿瘤转移显著减少，提示CXCL12/CXCR4生物轴介导了一种非血管生成依赖的肿瘤细胞转移方式。

ELR＋CXC趋化因子是非小细胞肺癌发生过程中非常重要的血管生成介质，手术切除的非小细胞肺癌标本显示CXCL8和肿瘤的血管生成直接相关，CXCL5的表达与肿瘤的生长、肿瘤源性的血管生成以及肿瘤的转移潜能直接相关。

CXC趋化因子家族中的血管生成抑制成员可以被干扰素诱导产生，抑制ELR-CXC趋化因子、bFGF和VEGF诱导产生的新生血管生成过程，这些发现提示所有干扰素诱导的ELR-CXC趋化因子都是潜在的血管生成抑制剂。干扰素和干扰素诱导产生的CXC趋化因子之间的相互关系以及它们的生物功能对其他细胞因子的功能起着重要的作用（例如能够刺激干扰素表达的Th1Ⅰ型细胞因子），IL-23、IL-18、IL-15、IL-12以及IL-2等细胞因子，以及CCL19、CCL21等趋化因子，通过诱导干扰素-γ的产生，可以严重影响CXCL9、CXCL10及CXCL11的产生。干扰素诱导的CXC趋化因子形成了一种最终共同通路，这可以部分地解释干扰素相关的血管生成的抑制。这个细胞因子间的级联链同Th1I型细胞因子介导的肿瘤相关抗原的免疫反应相连接，导致了一个新的概念的产生——“免疫血管抑制”。干扰素诱导产生的CXC趋化因子减弱了肿瘤发生相关的血管生成作用，CXCL9的高表达通过肿瘤源性血管生成的减少可以抑制非小细胞肺癌肿瘤的增殖及转移。

CXCR3是干扰素诱导产生的CXC趋化因子受体，CXCL9、CXCL10及CXCL11阻断内皮细胞增殖的作用是CXCR3依赖性的。CXCL9、CXCL10及CXCL11还可以抑制内皮细胞对CXCL8的趋化作用。

Th1T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞上也都发现了CXCR3的表达。在CCL21作用于肿瘤期间去除CXCL9、CXCL10或IFN-γ会明显削弱CCL21介导的抗瘤作用。另外，中和IFN-γ、CXCL9或CXCL10都会导致在肿瘤部位的CXCR3阳性T淋巴细胞和树突状细胞的减少，这些发现提供了证据说明IFN诱导的ELR-CXC趋化因子有可能在抗肿瘤免疫中也起着重要的作用。

趋化因子介导的肺癌器官特异性转移模式的证据：Paget 1889年首次描述了这样一种现象，癌有一种独特的转移模式，倾向于累及区域淋巴结、骨髓、肺和肝脏。最近，Müller等提出，乳腺癌细胞器官特异性转移直接与CXC趋化因子及其受体相关，他们发现，CXCR4是人乳腺癌细胞中表达最高的趋化因子，CXCR4的配体，SDF-1/CXCL12，在乳腺癌转移好发器官中mRNA表达最高。应用特异性抗CXCR4抗体阻断SDF-1/CXCL12/CXCR4的相互作用可以显著抑制乳腺癌的器官特异性转移。这些证据都提示乳腺癌的器官特异性转移与CXCR4-SDF-1/CXCL12之间的相互作用有关。

非小细胞肺癌细胞也表达CXCR4，但不表达它的配体SDF-1/CXCL12。SDF-1/CXCL12与非小细胞肺癌细胞的CXCR4受体相互作用，可以导致非小细胞肺癌肿瘤细胞的趋化现象、钙的运转以及有丝分裂原激活的蛋白激酶P42/44的激活。在那些容易出现肺癌转移的器官，SDF-1/CXCL12蛋白的水平远高于原发肿瘤以及血浆的水平，提示存在一个从原发肿瘤到肺癌转移器官的趋化梯度。分别检测原发肿瘤和转移肿瘤中CXCR4的表达发现，原发肿瘤中存在部分CXCR4阴性的肿瘤细胞，而在荷瘤裸鼠的肾上腺、肝脏、肺脏及骨髓中分离出来的肿瘤细胞中，超过99%的细胞表达CXCR4。另外，在人非小细胞肺癌裸鼠自发性肺转移系统中阻断SDF-1/CXCL12，可以引起包括肾上腺、肝脏、肺脏及骨髓等几个器官或组织的转移减少，而SDF-1/CXCL12/CXCR4的表达并没有增加肿瘤相关性血管生成或在体肿瘤生长的加速。这些发现均提供了强有力的证据，说明SDF-1/CXCL12/CXCR4生物轴有可能在非小细胞肺癌细胞向宿主全身几个特定器官转移的过程中起着重要的作用，这种作用不依赖于血管生成过程。

三、血管生成与肺癌的转移

早在1971年，Folkman就作出了一项假设：超过2mm的肿瘤的生长取决于新生血管的生成。早在20世纪60年代，初步的证据就显示肿瘤的血管生成是由肿瘤细胞产生的一种可以扩散的因子介导的。自此以后，越来越多的肿瘤细胞释放的血管生成细胞因子被发现。30%～40%的非小细胞肺癌有VEGF的高表达或有高的血管生成活性。有几项研究显示，在肺癌，无论是对总生存率还是无病生存而言，新生生血管生成都是一个明显的预后不良指标。

新生血管生成对于维持肿瘤的生长、侵袭和转移非常关键。现在，我们知道，除了肿瘤的增殖生长，肿瘤血管生成还参与了以下肿瘤发生发展过程：从恶性前状态到恶性肿瘤的早期转化过程、癌细胞侵入血液循环、潜伏的转移灶生长成为临床转移瘤。因此，血管生成参与了从癌发生的第一步到肿瘤增殖以及到远处转移的最后一步的全过程。

（一）非小细胞肺癌中几个重要的血管生成因子

血管内皮细胞生长因子（VEGF）：VEGF家族至少有5个成员（A，B，C，D，E），VEGF-A对血管生成最为重要。除了内皮细胞，VEGF还可以被其他几种类型的细胞所分泌，比如巨噬细胞、间质细胞、视网膜上皮细胞及恶性细胞。VEGF的靶细胞主要是血管内皮细胞，对其有强有力的促有丝分裂活性，作用于血管生成的每一步，但对其他良性细胞没有明显的促分裂活性。随着肿瘤的生长，由于离血管的距离逐渐增大，肿瘤细胞渐渐出现缺氧。这些细胞的缺氧通过提高VEGF mRNA的转录及增加其稳定性而导致VEGF的产生增加。尽管如此，缺氧却不是肿瘤产生VEGF的唯一原因，其他原因如p53的失活、RAS基因突变、Src基因的表达等，都可以导致VEGF表达的增加。

碱性纤维母细胞生长因子（bFGF）：bFGF是一个4号染色体短臂上一段基因编码的多肽，对内皮细胞具有致有丝分裂作用，是一种有力的血管生成诱导剂，但特异性较差，还可以作用于外胚层及内胚层起源的细胞，发挥致有丝分裂作用。在诱导血管生成方面和VEGF具有协同作用，另外，抗bFGF的单克隆抗体还能够抑制肿瘤的增殖。

血小板源性内皮生长因子（PD-ECGF）即胸腺嘧啶磷酸化酶，其分泌和肿瘤环境中的缺氧有关，其促血管生成作用机制为促进内皮细胞的迁移。PD-ECGF的高表达发生在大约40%的非小细胞肺癌，而正常肺组织中没有表达，非小细胞肺癌肿瘤及肿瘤间质表达的PD-ECGF明显地与血管生成相关，并且是生存不良的指标。

（二）微血管密度（MVD）、肿瘤细胞表达VEGF及bFGF在非小细胞肺癌中的预后价值

Macchiarini于1992年第一个应用MVD研究了血管生成在早期肺癌中的地位，其后有多项研究发表，但结果不一。荟萃分析显示，自1994年到2001年，有32项符合条件的研究发表，包括4　399例患者，其中23个提供了足够的数据用于评价风险比（HR）以及结果汇总。这23项研究中，7项应用第八因子免疫组化评价MVD，7项应用anti-CD31，9项应用抗CD34。结果发现，不管应用何种抗体评价MVD，在非小细胞肺癌原发肿瘤中MVD增高均对生存有明显不利的影响（HR：1.80～1.99）。

第一项关于VEGF在非小细胞肺癌中表达的研究由Mattern于1996年发表，结果显示肿瘤中VEGF的表达与不良预后相关，随后的多项研究报告了类似的结果。2002年的荟萃分析包括了20项符合条件的研究，17项研究提供了足够的数据用于评价HR和结果汇总，15项是关于非小细胞肺癌的（N＝1549），结果显示肿瘤中VEGF的高表达是一个显著的预后不良指标（HR＝1.48；95%CI：1.27～1.72）。

53%～74%的非小细胞肺癌表达bFGF，但bFGF在非小细胞肺癌发生发展中的地位不明。

（三）非小细胞肺癌患者血液循环中VEGF和bFGF的预后价值

评价MVD及肿瘤中血管生成因子的表达有赖于获得足够的手术或活检标本，而循环血液中的VEGF易于获得，理论上可以反映肿瘤总的血管生成活性，且具有以下优点：高度可得，更加经济，节约时间，易于连续重复检查，术前可作，较少偏倚。截止到2006年，有16项研究评价了血液中升高的VEGF水平和非小细胞肺癌预后的关系，其中10项评价了其与生存率的关系。分析结果显示，应用正确合理的分析监测方法，血液中VEGF水平的升高明显与不良预后相关。连续监测VEGF的含量也显示，术后VEGF的升高预示着术后早期转移的发生。化疗患者VEGF水平的变化也和化疗疗效明显相关，化疗有效者循环VEGF明显降低，而化疗无效者VEGF升高。有关非小细胞肺癌患者血液中bFGF的研究最早发表于1998年，其后又有4项研究发表，结果不一。