实训二 血液常规检查
一、血液常规检查(手工法)
实训目的
血液常规检查(blood routine test，BRT)也称血液一般检验或全血细胞计数(complete blood count，CBC)，是血液检验中最基础和最常用的检查项目。分为传统的手工基本项目检查(红细胞计数和血红蛋白测定、白细胞计数和白细胞分类计数)和血细胞分析仪多参数检查，具有广泛的临床应用：①协助疾病的诊断和鉴别诊断；②病情观察及预后判断；③某些疾病治疗的监护；④术前准备；⑤协助传染病及职业病的调查。
实训准备
双目电光源显微镜、改良牛鲍氏计数板、721或722分光光度计(含比色杯)、一次性微量吸管、真空负压采血管(含配套一次性采血针头)、一次性采血针、小试管、消毒棉签、75%医用酒精、医用纱布、吸水纸、压脉带、采血垫枕、载玻片、洗耳球、移液管、血细胞稀释液(红细胞用、白细胞用、血小板用)、文齐氏转化液、瑞氏染色液、显微镜清洁剂、香柏油、血细胞分析仪、联机电脑及相应配套试剂(稀释液、溶血素、清洗液等)、记录纸、笔等。
实训内容
1.血细胞手工计数 白细胞、红细胞、血小板。
2.血红蛋白测定 测定全血中血红蛋白浓度。
3.白细胞分类计数 外周血中中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞占白细胞总数的百分比。
4.外周血细胞形态检查 红细胞、白细胞、血小板异常形态检查、血液寄生虫检查等。
实训方法
1.血细胞手工计数 操作：①取稀释液；②采末梢血或静脉血，进行血液稀释，混匀；③充池；④镜检，计算一定范围内的血细胞数；⑤换算成每升血细胞数。各血细胞计数方法的比较见表2-1。
表2-1 三种细胞手工计数方法的比较
2.白细胞分类计数和细胞形态检查 操作：①采末梢血或静脉血；②推制血涂片2～3张；③选择较好的一张进行瑞氏染色；④干燥后，在显微镜下分类计数100个白细胞，计算报告百分比，并观察红细胞、白细胞、血小板异常形态检查并注意有无血液寄生虫等。
3.血红蛋白测定(HiCN法) 操作：①开启721或722分光光度计预热20分钟；②取 转化液5 ml置于中型试管；③采末梢血20 μl，混匀，放置5分钟；④调整分光光度计波长为540 nm，用转化液调“零”，测定待测品的吸光度值(A)；⑤计算，Hb(g/L)=KA(K值为换算系数，理想条件下K值为366.7，也可根据标准品，绘制标准曲线，计算K值)。
4.注意事项
(1)注意基本信息,如姓名、性别、年龄、科室、临床诊断的相关资料等。
(2)标本类型和检查项目，血常规检查标本一般为全血抗凝标本，抗凝剂为EDTA-K2(紫色帽)，有时医生对项目和方法有特殊要求，如血小板手工计数。
(3)消除待检者生理因素如年龄、性别、运动、情绪、饮食、药物等对结果的影响，标本采集顺利，一针见血。
(4)标本编号，及时检验，防止张冠李戴，注意日期和签名，防止差错。
实训结果
填写或粘贴检验报告单。
实训思考
1.外周血检验血液寄生虫有哪些？有哪些方法？
2.外周血中核象如何判断？有何价值？
3.外周血细胞形态检查的意义有哪些？
4.正确看待白细胞参数：白细胞参考范围是(4.0～10)×109/L，但大多数“健康”人群在(5.0～7.0)×109/L范围。如某患者潜在炎症、感染、坏死、结缔组织病变等，检查结果为9.0×109/L，虽然还处于正常范围，但也说明增高，如果白细胞分类中中性粒细胞增多，更能说明机体对病原的刺激产生了反应。类似的情况还有白细胞不增型的类白血病反应(leukomoid reaction，LR)，虽然白细胞总数未增高，但外周血白细胞幼稚化，出现明显的核左移(shift to the left)。
(严家来 徐素仿)
二、全自动血液细胞分析仪检查(BC-5180型)
实训目的
掌握全自动血液细胞分析仪的原理、使用方法等。熟悉血液白细胞计数及分类，红细胞计数，血小板计数，血红蛋白测定，红细胞压积，红细胞体积分布宽度，平均红细胞血红蛋白含量，平均红细胞血红蛋白浓度，平均红细胞体积，血小板体积分布宽度、平均血小板体积和血小板压积等直方图、散点图的检验意义。
实训原理
1.电阻抗法原理 本分析仪利用库尔特原理红细胞/血小板计数以及白细胞/嗜碱性粒细胞等进行检测。检测样本经过二次稀释后进入白细胞检测单元。检测单元有一个小的开口，叫做检测小孔。小孔两侧有一对正负电极，连接恒流电流。由于细胞具有不良导体的特性，稀释样本中的细胞在恒定的负压的作用下通过检测小孔的时候，电极间的直流电阻就会发生变化，从而在电极两端形成一个同细胞体积大小成比例的脉冲信号。当细胞连续地通过小孔，就在电极两端产生一连串的电脉冲，脉冲的个数与通过小孔的细胞数相当，脉冲的幅度与细胞的体积成正比。将采集到的电脉冲放大后与正常的白细胞/嗜碱性粒细胞体积范围所对应的通道电压阈值相比较，计算出电脉冲幅度落在白细胞/嗜碱性粒细胞通道内的电脉冲个数。由此，所有采集到的电脉冲根据不同的通道电压阈值进行分类，落在白细胞/嗜碱性粒细胞通道内的电脉冲个数就是白细胞/嗜碱性粒细胞的个数。依据脉冲电压幅度划分的每一个通道范围内的细胞个数决定了细胞的体积分布。用横坐标表示细胞体积、纵坐标表示细胞相对数量的二维图就是反映细胞群体分布情况的直方图。
2.激光流式细胞计数原理 当一定的血细胞被吸入并经过特定量的试剂作用后，血样经喷嘴注入充满稀释液的圆锥形的流动室中。在稀释液形成的鞘液包裹下，细胞单个排列成行地穿过流动室的中央。当悬浮在鞘液中的血细胞经过二次加速后通过激光检测区时，血细胞受到激光束的照射，产生的散射光性质与细胞大小、细胞膜和细胞内部结构的折射率有关。低角前向散射光反映了细胞的大小，高角前向散射光则反映细胞的内部精细结构和颗粒物质。光电二极管接收这些散射光信号并将其转化为电脉冲，根据采集到的这些电脉冲数据，可以得到血细胞大小及细胞内部信息的二维分布图，称为散点图，横坐标反映细胞的内部复杂度信息，纵坐标反映细胞的体积。
实训内容
(一)单样本测定。
(二)多样本连续测定。
实训准备
全自动血液细胞分析仪BC-5180或BC-5380血液细胞分析仪专用试剂：M-53D稀释液；M-53LEO(Ⅰ)溶血剂；M-53LEO(Ⅱ)溶血剂；M-53LH溶血剂；M-53清洁液；M-53P探头清洁液。所有试剂应参照试剂的使用说明进行保存，变质、超过效期的所有试剂不能使用，采血针、EDTA-K2抗凝管(紫色帽)、一次性负压采血针、压脉带、试管架、75%医用乙醇、碘酒、打印纸、记号笔、一次性手套。
实训方法
1.开机前准备 检查试剂是否足量，废液桶是否为空，管路、电路、打印机连接是否正常。
2.开机和用户登录(图2-1) 将主机左侧的“0/1”电源开关置于“1”，电源开关亮，并确认主机上的指示灯亮，打开外置计算机和显示器，进入操作系统后，双击“BC-5180血液分析仪”图标，运行已安装的配套软件，软件启动后，在弹出的登录对话框中，输入123用户名和123密码后，点击“确定”开始执行开机初始化操作，初始化完毕后，可进入“图形回顾界面”，以查看开机本地的检测结果。
图2-1 开机和用户登录
3.本地检查 在主界面点击快捷按钮区的“图形回顾”按钮，检查显示在“图形回顾”界面的本地结果是否满足以下要求。
4.每日质控 在进行样本分析前，每日需对分析仪进行质控分析。
5.选择工作模式 见图2-2、图2-3。
图2-2 工作模式
(1)在主界面点击快捷按钮区的“计数”按钮，弹出计数对话框。
(2)点击模式项的“自动-全血”、“封闭-全血”或者“封闭-预稀释”单选按钮选择需要的工作模式。
(3)点击“CBC”或“CBC+DIFF”单选按钮选择测量模式。
(4)在“样本编号”框输入下一个分析样本的样本编号。对于“自动-全血”模式，如选择使用内置条码扫描仪自动录入下一个分析样本的编号，点击“内置条码扫描”复选框，在“管架号”、“试管号”编辑框中输入起始样本的管架号和试管号。管架号的输入范围为1～100，试管号的输入范围为1～100。
(5)设置完成后，点击“确定”按钮，保存输入的内容。
(6)操作者也可在样本分析前，点击快捷按钮区的“工作单”按钮，录入和修改待分析样本的完整工作单信息。
图2-3 计数过程
6.封闭进样全血测量
(1)按仪器上的[开仓]键，打开样本仓门。
(2)混匀用EDTA-K2(1.5～2.2)mg/ml血抗凝的样本，放到样本仓门内，关闭样本仓门。
(3)按主机上的[计数]键，分析仪自动执行样本分析。
(4)分析结束后，样本仓门自动打开，可取走样本。
7.封闭进样预稀释测量 执行封闭进样预稀释测量，要选用规格为Ø11×40(mm)的适配器。
(1)在主界面点击快捷按钮区的“加稀释液”按钮，样本仓门自动打开。按照界面提示，取一个干净的离心管，开盖放入样本仓后关闭仓门。
(2)按主机上的[计数]键，让分析仪自动排出稀释液。加稀释液完毕后，样本仓门自动打开，取出离心管。操作者也可使用移液器移取180 μl稀释液到离心管中。
(3)点击“取消”按钮，关闭并退出加稀释液的操作。
(4)人工采集20 μl血样注入盛有稀释液的离心管中，盖好盖子后混匀。
(5)将该预稀释液血样放置3分钟后，再次混匀，开盖后放到样本仓内，关闭样本仓门。
(6)按主机上的[计数]键，分析仪自动执行样本分析。
(7)分析结束后，样本仓门自动打开，可取走样本。
8.自动进样全血测量
(1)如使用内置条码扫描仪自动录入下一样本编号，将粘贴好条码标签的样本试管放入试管架。
(2)如未配置内置条码扫描仪，将试管按照样本编号顺序依次放入试管架的各试管位中。
(3)将放置好试管的试管架依次水平放置在进样器的右侧槽中,将有“MINDRAY”标志的一侧背向主机。一次最多能同时放置4个试管架。
(4)按主机上的[计数]键，分析仪自动执行样本分析。
(5)分析结束后，所有试管架自动移到进样器的左侧槽中，可取走样本。
9.休眠 液路相关操作停止的时间超出设定的时间间隔后，分析仪会自动进入休眠状态。此时，仍可以执行与液路无关的任意操作。操作者也可以在主界面点击“菜单”按钮，在弹出的菜单中，选择“关闭仪器”→“仪器休眠”，使分析仪进入休眠状态。分析仪处于休眠状态时，可按主机上的[计数]键取消休眠，也可在主界面上的点击“菜单”按钮，在弹出的菜单中选择“关闭仪器”→“取消休眠”，使分析仪退出休眠状态。
10.关机 每日工作完毕，在主界面点击快捷按钮区的“关闭仪器”按钮执行关机，并按照界面的提示将主机左侧的“0/1”电源开关置于“0”以关掉主机电源。在主界面点击快捷按钮区的“退出系统”按钮，退出终端软件。按照操作系统的关机流程关闭外置计算机及其外接设备。清空废液桶中的废液，并妥善处理(图2-4)。
图2-4 关机过程
实训结果
填写或粘贴检验报告单。
实训思考
1.三分群和五分类血细胞分析仪区别在哪里？
2.报告出现异常的幼稚细胞怎样处理？
病例分析
1.某李姓农民，男性，30岁，主诉：头昏，发热入院。查体：贫血貌，皮肤散发出血点，浅表淋巴结肿大，胸骨下端轻压痛，心肺(-)，腹软，肝、脾肋下未触及。实验室检查：RBC 4.0×1012/L，HGB 100 g/L，LYM 0.60，GRAN 0.20，MID(三分群血细胞分析仪)0.20。请你思考：①可能的初步诊断是什么？②如何进行进一步检查以确诊？
2.某男孩，1岁。面色苍白1个月，易疲乏，时而烦躁，纳差。查血常规：Hb 86 g/L，RBC 3.45×1012/L，MCV 68 fL，MCH 20 pg，MCHC 260 g/L。请思考：①最可能的诊断是何种贫血(A.叶酸缺乏性贫血；B.缺铁性贫血；C.再生障碍性贫血；D.维生素B12缺乏性贫血；E.生理性贫血)？②为什么？
(陈雨京 严家来)
【附2.1】 BC-5180型全自动血液细胞分析仪仪器校准
1.仪器校准原则血液细胞分析仪校准周期为一年1～2次。
2.仪器校准步骤
(1)校准用样本的选择与定值:选择EDTA-K2抗凝的新鲜正常的全血样本(抽血8 ml，平均分为4份)，用标准血液细胞分析仪精确测量白细胞、红细胞、血红蛋白、MCV和血小板的平均值、标准差及CV值，其统计结果作该正常全血样本的定值(确认各参数检测结果的精密度在仪器说明书要求的范围内)。
(2)校准过程
①用1管校准物，连续检测11次(第1次检测结果不用，以防止携带污染)，将结果记录，计算出WBC、RBC、HGB、MCV及PLT参数的平均值、标准差及CV值。
②用上述检测校准物的均值与定值比较，以判断是否需要校准仪器。
计算各参数的均值与定值相差的百分数(不计正负号)，即偏差，计算公式：
[(均值-定值)/定值]×100%
用偏差与仪器校准的判别标准进行比较。WBC、RBC、HGB、MCV及PLT参数均值与定值的差异全部等于或小于附表中的第一列数值时，仪器不需要进行校准，记录偏差的数据。若各参数均值与定值的差异大于附表中的第二列数值时，仪器不能校准，需请维修人员检查原因并进行处理；若各参数均值与定值的差异在表中第一列与第二列数值之间时，需要对仪器进行校准，具体校准方法可按说明书的要求进行。
③若仪器需要校准，则计算出WBC、RBC、HGB、MCV及PLT参数新的校准系数(仪器原有的校准系数乘以定值除以所测校准物的均值，即为新的校准系数)。
3.校准结果的确认 BC-5180血液细胞分析仪校准通过标准条件为：仪器校准后，应重新测试同一份校准物3次。只有当被校准参数的测定值与定值的差异等于或小于下表第一列数值，该校准才被认可。
4.质量控制 见图2-5。
图2-5 质控过程
(1)室内质控
(2)质控分析:见图2-6。
图2-6 质控分析
(3)质控图回顾:见图2-7。
图2-7 质控图回顾
(4)质控列表回顾：见图2-8。
图2-8 质控列表回顾
(5)失控处理
①失控原因分析及采取的相应措施:如果质控结果超出质控偏差范围，建议按以下步骤操作，直至问题解决。
A.检查质控编辑内容，如输入有误，进行修改。
B.执行本底检测，如本底异常，参考“故障处理”进行排除。
C.重新执行质控计数。
当质控测试超出偏差限，用同瓶质控再测试一次，在偏差限范围则仪器工作正常，如还超偏差限，记录“室内质控失控报告单”。
同一批号换一瓶质控进行测试2次。如其中一次结果在偏差限范围，则仪器工作正常；如都超偏差限，记录“室内质控失控报告单”，评估是否对仪器进行校准或维修。
D.确认是否为仪器校准的问题。
E.如果上述步骤都未能得到在控结果，提示仪器可能出现故障，应联系维修人员。
②填写失控报告
A.操作人员发现失控后，应立即通报主班。失控期间，失控项目不得发出报告，如有发出，应予以追回。尽快查明引起失控的原因，采取相应的纠正措施。
B.纠正完毕后，需填写失控报告，由经手人、专业组长和科主任签字，并保存失控处理记录。
③室内质控数据管理
A.每个月的月末，应对当月的所有质控数据进行汇总和统计处理，并填写当月所有测定项目的室内质控月报表。
B.每个月的月末，应对室内质控数据进行周期性评价。如果发现有显著性的变异，就要对质控图的均值、标准差进行修改，并要对质控方法重新进行设计。
C.每个月的月末，应填写该月所有测定项目的室内失控情况汇总表。
5.注意事项
(1)电源要求
A.分析仪必须在良好的接地条件下使用；
B.确认输入电压符合分析仪要求。
(2)环境要求
A.正常工作温度范围：15～30 ℃；
B.运行温度范围：10～40 ℃；
C.正常工作湿度范围：30%～85%；
D.正常工作大气压力范围：70～106 kPa；
E.环境应尽可能无尘，无机械振动，无污染，无大噪音源和电源干扰；
F.建议在运行设备之前对实验室的电磁环境进行评估；
G.切勿将设备靠近强电磁干扰源，以免影响设备的正常运行；
H.不要靠近电刷型电机、闪烁荧光灯和经常开关的电接触性设备；
I.避免阳光直射或置于热源及风源前，选择一个通风良好的位置；
J.不要将主机放置在斜面上。
(3)故障处理:若出现故障，可点击界面下方的故障信息区，获取故障帮助信息，还可点击“消除故障”按钮，一键消除所有可消除的故障。
(4)日常维护:每日应执行正常关机。样本计数次数累计已达到或超过1 000次时，应执行一次探头清洁液浸泡；若样本量较少，分析仪每使用2周应执行一次探头清洁液浸泡。
(陈雨京 严家来 王文明)
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