实训九 微生物学检查
一、肠道杆菌生化反应
实训目的
细菌的鉴定多依赖细菌各种生化反应，掌握常用生化反应的名称、基本原理及接种方法，熟悉常用生化反应培养基反应前的颜色，掌握其所需指示剂及结果判断方法。
实训内容
标本菌株：大肠埃希菌、伤寒沙门菌、产气肠杆菌、普通变形杆菌、肺炎克雷伯菌。
1.单糖发酵试验。
2.IMViC(吲哚、甲基红、VP、枸橼酸盐利用试验)。
3.尿素分解试验。
4.硫化氢试验。
5.双糖铁(KIA)试验。
实训原理
1.单糖发酵试验 各种细菌含有不同的糖分解酶，分解糖的能力不同，有些细菌能分解糖产酸产气，有些只产酸，而有些细菌则不能分解糖，借此可协助鉴别细菌，尤其在肠道细菌的鉴定中经常使用。单糖发酵是将葡萄糖、乳糖等分别加入蛋白胨培养基内(实验室常用葡萄糖发酵管及乳糖发酵管)，并加入一定量的酸碱指示剂及一支倒置小玻璃管。接种细菌，经37 ℃培养18～24小时后，细菌分解糖产酸则指示剂发生酸性反应(变色)；如产气则倒置小管顶部有气泡。
2.吲哚试验 有的细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，产生靛基质(即吲哚)，吲哚无色，不易观察，加人吲哚试剂后，试剂中的对二甲基氨基苯甲醛与吲哚结合，生成红色的玫瑰吲哚，易于观察。
3.甲基红试验 某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸继续被分解，则可产生甲酸、乙酸、琥珀酸、乳酸等，这样使培养基的pH降至4.5以下，这时加人甲基红指示剂呈红色。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质(如醇、酮、醛、气体和水等)，则培养基的pH仍在6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色。本实验常用于鉴定大肠埃希菌与产气肠杆菌。
4.VP试验 丙酮酸在丙酮酸脱羧酶作用下生成中性的乙酰甲基甲醇，并在碱性环境中被氧化成二乙酰，进一步与培养基中的精氨酸的胍基结合，形成红色化合物。
5.枸橼酸盐利用试验 某些细菌可利用枸橼酸盐作为碳源，并分解产生碳酸盐，使培养基变成碱性，指示剂溴麝香草酚蓝变为深蓝色。
6.尿素分解试验 某些细菌具有脲酶，能分解尿素产生氨，使培养基呈碱性，酚红指示剂变成红色。
7.硫化氢试验 某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸生成硫化氢，硫化氢与培养基中的醋酸铅或硫酸亚铁作用生成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀。黑色沉淀越多，表示生成的硫化氢量也越多。
8.双糖铁(KIA)试验 是检测细菌分解葡萄糖、乳糖及是否产生硫化氢的组合试验，常用于肠杆菌科细菌的鉴定。指示剂为酚红，酸性时呈现黄色，碱性呈现红色。细菌分解葡萄糖、乳糖产酸产气，使斜面和底层均呈黄色，且有气体；有的细菌只产酸不产气体。若细菌只分解葡萄糖，不分解乳糖，分解葡萄糖产酸，斜面和底层先呈黄色，由于培养基中，葡萄糖与乳糖的比例为1∶10，葡萄糖含量少，所生成的少量的酸被空气中的氧所氧化，并因细菌生长繁殖利用含氮物质生成碱性化合物，中和斜面部分的酸，使斜面又恢复成红色。底层因处于缺氧状态，细菌分解葡萄糖所生成的酸一时不被氧化而仍保持黄色。细菌分解胱氨酸产生硫化氢，硫化氢与培养基中亚铁离子作用，生成黑色的硫化亚铁。
实训方法
1.单糖发酵试验 将大肠埃希菌、伤寒沙门菌等分别接种于葡萄糖或乳糖发酵管中，置37 ℃温箱中培养18～24小时，观察结果。
2.吲哚试验 将大肠埃希菌、伤寒沙门菌等分别接种于蛋白胨水中，37 ℃培养18～24小时后取出，沿培养基管管壁缓慢加人吲哚试剂数滴，观察结果。
3.甲基红试验 将大肠埃希菌、伤寒沙门菌等分别接种于葡萄糖蛋白胨水中，37 ℃培养18～24小时后取出，分别滴入甲基红试剂2～3滴，观察结果。
4.VP试验 将大肠埃希菌、伤寒沙门菌等分别接种于葡萄糖蛋白胨水中，37 ℃培养18～24小时天后取出，分别滴入VP试剂2～3滴，观察结果。
5.枸橼酸盐利用试验 将大肠埃希菌、伤寒沙门菌等分别接种于枸橼酸盐培养基中，37 ℃培养18～24小时天后取出，分别滴入VP试剂2～3滴，观察结果。
6.尿素分解试验 将大肠埃希菌、伤寒沙门菌等分别接种于尿素培养基中，37 ℃培养18～24小时天后取出，观察结果。
7.硫化氢试验 分别将大肠埃希菌、伤寒沙门菌等接种于醋酸铅或硫化亚铁培养基或H2S试验微量管中，37 ℃培养18～24小时后观察结果。
8.双糖铁(KIA)试验 将大肠埃希菌、伤寒沙门菌等用接种针接种于双糖铁(KIA)培养基中(底层穿刺，斜面划线)，37 ℃培养18～24小时后观察结果。
实训内容
填写或粘贴检验报告单。
实训思考
试分析大肠埃希菌、伤寒沙门菌、肺炎克雷伯氏菌、产气肠杆菌、普通变形杆菌KIA结果。
病例分析
某患者，女，36岁，肝脏肿瘤切除术后有尿路感染症状，尿液细菌培养示革兰阴性杆菌>105/ml，氧化酶阴性，怀疑为大肠埃希菌。如何进行初步鉴定？
(楼 研 房功思 杨勇麟)
二、尿液标本中大肠埃希菌鉴定及药物敏感试验测定
实训目的
掌握尿液标本细菌接种、培养的方法技术，掌握大肠埃希菌鉴定及药物敏感试验方法技术。
实训内容
1.标本菌株 大肠埃希菌ATCC25922。
2.HX-21细菌鉴定药敏分析仪鉴定及药敏测试。
实训方法
1.标本采集 中段尿，通常应采集晨起第一次尿液送检。原则上应选择在抗菌药物应用之前采集尿液。
(1)女性病人：由护士局部消毒后留取。
(2)男性病人：清洁尿道口，留取中段尿约3 ml入无菌试管中，送检。
2.标本接种、培养 用定量接种环(10 μl)挑取尿液一环，取血液琼脂平皿，先划一竖线，然后，沿着竖线横向密集划线。将血液琼脂平皿置35 ℃、5% CO2孵箱孵育18～72小时。
3.细菌初步鉴定
(1)经24小时培养，出现大量圆形、直径2～3 mm、稍凸、边缘整齐、灰白色、不透明菌落，革兰染色结果为革兰阴性杆菌。尿液标本菌落计数≥10×5 cfu/ml,有临床诊断价值。培养若出现三种及三种以上微生物生长,判断为污染标本，重新采集培养。
(2)取单个典型菌落进行氧化酶试验，氧化酶试验结果为阴性，初步判断为肠道杆菌。接种KIA培养基、蛋白胨水培养基、MAC培养基。
4.细菌鉴定及药物敏感实验
(1)观察KIA、吲哚试验结果及MAC培养基菌落特征。
KIA:A A+-。
MAC：不透明、粉红色菌落。
吲哚试验：蛋白胨水培养基滴加对二甲基氨基苯甲醛1天，显玫瑰红色，阳性。根据上述结果初步判断为大肠埃希菌。
(2)标本菌进行HX-21细菌鉴定药敏分析仪鉴定及药敏测试(附9.3)。
实训结果
填写或粘贴检验报告单。
实训思考
1.大肠埃希菌IMViC及KIA、MIU试验结果是什么？
2.什么是ESBLs+细菌，使用何种药物初筛？如何进行确诊试验？
(房功思 楼研 杨勇麟)
三、血液标本中金黄色葡萄球菌鉴定及药物敏感试验测定
实训目的
掌握血液标本细菌培养的方法技术，掌握金黄色葡萄球菌鉴定方法及药物敏感试验方法技术。
实训内容
1.标本菌株 金黄色葡萄球菌MRSA。
2.双相血培养瓶。
3.HX-21细菌鉴定药敏分析仪鉴定及药敏测试。
实训方法
1.标本采集
(1)采血时间：应在病人发热初期或发热高峰时采集。一般情况下，要选择在抗菌药物治疗之前，对已用药而不能中止的病人，应在下次用药之前采集。
(2)采血量：成人菌血症或败血症的血液中含菌量较少，平均1～3 ml血液中仅有1个细菌，采血量要足够。成人一般为5～10 ml，新生儿与婴幼儿为2～3 ml。
(3)无菌操作：无论采取何种方法，在血液培养的全过程，从皮肤消毒、标本采取、运行、分离移种等，应注意无菌操作。用头皮针为新生儿和婴幼儿取血时，应换针头再将血注入普通血培养瓶中。
2.培养 颠倒混匀普通血培养瓶培养液，将普通血培养瓶放入35 ℃孵箱内，每日观察。如浑浊度明显改变或固相长有菌落，提示为阳性标本。培养瓶经孵育6日，在血琼脂或巧克力平板上盲目传种一次，以免漏检。培养至7日方可报告“培养7日无细菌生长”。
3.血培养过程中发现阳性，进行临床三级报告。
(1)一级报告(初步)：挑取一滴培养物进行革兰染色镜检，发现革兰阳性簇状排列球菌，将染色镜检结果电话通知临床，并取培养物血平板及普通琼脂平板分离培养同时进行直接药敏试验(K-B法，药物选择见附录4)。
(2)二级报告(中级)：报告直接药敏试验结果和初步报告结论，电话通知临床。取标本菌进行革兰染色，发现革兰阳性簇状排列球菌。取普通琼脂平板培养物进行触酶试验，试验结果阳性。根据血平板菌落特征、染色形态特征、触酶试验阳性，确定为葡萄球菌属。取标本菌进行血浆凝固酶试验(玻片法和试管法)，结果阳性；根据药物敏感试验结果：青霉素及苯唑西林耐药，初步判断为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA。
标本菌进行HX-21细菌鉴定药敏分析仪鉴定及药敏测试具体操作(附9.3)。
(3)三级报告(终报告)：报告细菌种属、药敏试验、结果评价和建议。
实训结果
填写或粘贴检验报告单。
实训思考
1.金黄色葡萄球菌的鉴定程序是什么？
2.如何确定MRSA？
(房功思 楼 研 杨勇麟)
【附9.1】 肠杆菌HX-21细菌鉴定药敏分析仪鉴定及药敏测试
1.挑取单菌落于5 ml无菌生理盐水中制成0.5麦氏单位的混悬液(A管)，从中吸取0.1 ml，加入10 ml无菌盐水中混匀(B管)。A、B两管分别倒入经灭菌的V形槽内，制备成A液、B液。
2.利用12道微量加样器吸取A液，加入试剂板A、B两排24孔中，每孔0.1 ml。
3.利用12道微量加样器吸取B液，加入试剂板C、D、E、F、G、H等6排孔中，每孔0.1 ml。
4.A1、A2、A3、A4等孔另加入无菌石蜡油3～4滴。
5.盖好试剂板，置于35 ℃培养箱培养18～24小时。
6.另挑取单菌落，穿刺半固体培养基，35 ℃培养过夜，观察动力。沿穿刺线生长未扩散者为阴性，弥漫性生长，管内呈云雾状者为阳性。
7.在培养好的试剂板中添加辅助试剂 B1加靛基质3滴，B2孔加甲基红1滴，B3孔加苯丙氨酸1滴，B4孔加硝酸盐还原试剂甲、乙液各1滴(先加甲液，后加乙液)，B5孔加VP甲、乙液各1滴(先加甲液，后加乙液)。放入35 ℃孵育10分钟。注意：苯丙氨酸孔加入试剂后应该立即观察，变草绿色为阳性，不变色者为阴性，人工输入该结果。VP变色可能需要较长时间。
8.结果判读 见附9.3 HX-21细菌鉴定与药敏分析系统操作指南。
注意：菌种模式必须选择“肠杆菌”。
【附9.2】 葡萄球菌HX-21细菌鉴定药敏分析仪鉴定及药敏测试
1.菌悬液的制备 挑取单菌落于5 ml无菌生理盐水中制成0.5麦氏单位的混悬液(A管)，从中吸取0.1 ml，加入10 ml无菌盐水中混匀(B管)。A、B两管分别倒入经灭菌的V形槽内，制备成A液、B液。
2.用12道微量加样器吸取A液，加入试剂板A、B排12个孔中，每孔0.1 ml。
3.利用12道微量加样器吸取B液，加入试剂板C、D、E、F、G、H等6排孔中，每孔0.1 ml。
4.A1、A2、A3另加入无菌石蜡油3～4滴。
5.盖好试剂板，置于35 ℃培养箱培养18～24小时。
6.在培养好的试剂板中添加辅助试剂：B1孔加硝酸盐还原试剂(甲、乙液)各1滴，B2孔加VP试剂甲、乙液各1滴(先甲液、后乙液)。35 ℃孵育10分钟。
7.结果判读 见附9.3 HX-21细菌鉴定与药敏分析系统操作指南。
注意：菌种模式必须选择“葡萄球菌”。
【附9.3】 HX-21细菌鉴定与药敏分析系统操作指南
计算机开启后进入Windows系统，出现图9-1界面。
图9-1
击“恒星细菌分析系统4.0”，弹出图9-2界面。
图9-2
输入正确的用户名称和口令，单击确定(用户名H，密码X)，进入图9-3界面。
图9-3
3.系统操作
(1)标本登记
①临床标本登记
单击主菜单“标本登记(C)”，出现图9-4下拉菜单。
图9-4
单击“临床标本登记”进入临床标本登记，弹出图9-5界面，此界面可以进行病员信息登记、修改。
图9-5
用鼠标或“Enter”键定位光标至文字输入框，输入各项资料，如图9-6所示。
图9-6
单击“保存”将病员的资料存入系统内。如需继续输入病员的资料，单击“新增”，重复以上操作。
②院内感染标本登记同①。
③质控标本登记同①。
(2)临床报告：鉴定分析
单击主菜单“临床报告(D)”，出现图9-7下拉菜单。
图9-7
单击“鉴定分析”进入鉴定分析，弹出图9-8界面。
图9-8
单击“标本登记”弹出图9-9界面，此界面可以进行病员信息提取。
图9-9
选中需要的病员，单击“提取”，将病员信息转移到鉴定界面。如图9-10所示。
图9-10
单击“菌属”下拉菜单，选中正确的菌属，如图9-11所示。若需要再输入镜检结果和检验医生评语。
图9-11
单击“开始检查”出现如图9-12界面，系统将读取试剂板上的信息。
图9-12
经过一分钟，系统获得试剂板上的信息后，进入到下一个界面，如图9-13所示。
图9-13
系统自动将生化反应结果显示在图9-13中对应的位置，输入前期试验结果(如动力、氧化酶等)，单击“细菌分析”，系统将自动分析得到鉴定结果，在细菌鉴定程序中，系统拥有二级专家系统，当细菌的生化反应结果不明显或出现错误时系统自动启动一级专家系统、二级专家系统，使鉴定结果更准确可靠。单击“药敏分析”，系统将出现药敏试验结果，系统对药敏试验有1 000余条规则，包括多重耐药机制、天然耐药和天然敏感报告、交叉耐药等。需要修改结果，选择人工输入，进行细菌分析后，就可人工输入修改内容。若需要添加试剂板中没有的药敏试验，单击“附加药品”，加入附加的药敏试验结果，如图9-14所示。
图9-14
完成后，单击“确定返回”，返回细菌分析界面，单击“存盘”，保存数据。单击“打印(P)”，打印结果报告单(表9-1)。
表9-1 人民医院微生物检测报告单
检验结果：大肠埃希菌 Escherichia coli
ESBL:
续表9-1
报告者：登录用户中文名 审核者：
×××本报告仅对本标本负责，本报告单仅供临床医生参考×××
注：IM肌内注射;IV静脉注射;ID静脉滴注;O口服
判读时注意事项：
(1)拖尾现象(敏感):细菌在加入试剂板后，试剂板孔内抗生素作用细菌时需要时间，在此时间内细菌已经生长繁殖几代，出现微弱浊度。对只能抑制细菌生长的抗药物，此微弱生长将始终伴随,而可杀灭细菌生长的药物，此微弱生长将会消除。
(2)点状、片状生长(耐药)：有些细菌在乳化过程中不能有效完全被乳化，会出现几个细菌结成在一起。在试剂板空内会出现点装或片状生长。
(3)天然耐药
①嗜麦芽窄食单胞菌：亚胺培南；
②克雷伯菌：氨苄西林；
③肠杆菌属：氨苄西林、头孢唑林；
④摩根菌：氨苄西林、头孢唑林；
⑤枸橼酸杆菌：氨苄西林；
⑥普罗威登斯菌：头孢唑林；
⑦普通变形杆菌：氨苄西林、头孢呋辛、头孢噻吩；
⑧沙雷菌：氨苄西林、头孢唑林、头孢呋辛；
⑨宋内氏志贺菌：氨苄西林；
⑩黄杆菌：头孢吡肟；
不动杆菌：头孢哌酮；
母鸡肠球菌：万古霉素；
酪黄肠球菌：万古霉素；
粪肠球菌：林可霉素、可林霉素、头孢菌素类；
屎肠球菌：林可霉素、可林霉素、头孢菌素类；
奇异变形杆菌：呋喃妥因、四环素；
铜绿假单胞菌：四环素、SMZ；
产气肠杆菌：头孢西丁；
阴沟肠杆菌：头孢西丁、氨苄西林、苯唑西林；
洋葱伯克霍尔德菌：氨基糖苷类、亚胺培南。
(4)天然敏感(少见耐药)
①葡萄球菌：万古霉素；
②肠杆菌：亚胺培南(产诱导酶除外)；
③非发酵菌：亚胺培南(嗜麦芽窄食单胞菌除外)；
④志贺菌：氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星等；
⑤链球菌(肺炎链球菌、B群链球菌、草绿色链球菌外)：青霉素；草绿色链球菌包括：咽峡炎链球菌群、变异链球菌群、唾液链球菌群、血液链球菌群、缓症链球菌群、草绿色链球菌群等；
⑥链球菌：头孢三代、万古霉素；
⑦奇异变形杆菌：哌拉西林。
(房功思 楼研 杨勇麟 徐元宏 胡万富)
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