塑料包埋制片染色技术

传统的组织病理制片方法为甲醛固定、石蜡包埋切片，苏木素-伊红（HE）染色。该方法由于脱水、加温、浸蜡可使细胞严重收缩，且HE染色对胞质颗粒的显示不是很清晰。因此不利于幼稚造血细胞（特别是粒细胞）的辨认。中国医学科学院血液学研究所于20世纪80年代初开始采用甲基丙烯酸羟乙基酯（2-hydroxyethyl-metacrylate，HEMA）作为骨髓活检包埋剂半薄切片，用于血液病的诊断。实践证明，塑料包埋薄切片时细胞收缩很小，胞质及胞核细微结构清楚。采用骨髓特殊固定及染色方法，各种造血细胞胞质色彩层次丰富，可在光镜下辨认骨髓切片中的各系及其各分化阶段细胞。当然，塑料包埋病理切片也适合于骨组织及软组织标本病理制片，尤其是对于淋巴瘤的形态学分型是最理想的包埋制片方法。

塑料包埋的基本原理是利用亲水性的HEMA能渗透入组织中并能在催化剂和加速剂的作用下发生聚合的原理，把组织包埋在坚硬的塑料聚合体中，以便切片直接染色。HEMA无气味、无刺激、无环境污染。固定、脱水、包埋全过程无需加温。细胞形态结构保存较好是最大优点。不足之处是目前尚不能常规用于免疫组化。

塑料切片制作的主要步骤:①固定;②脱钙;③脱水;④浸透;⑤包埋;⑥切片;⑦染色;⑧封片。

（一）固定

固定的目的是使组织尽可能地保持在活体内原有的形态，使细胞内的蛋白质变性，由正常的半液体溶胶状态转变为不可逆的半固体凝胶状态。因此固定必须迅速、充分、透彻，有利于细胞内水分脱出和包埋剂（塑料）浸入以及细胞对酸、碱染料的着色。否则，浸透液和包埋液不能充分地浸入组织中，导致包埋时组织周围的包埋剂聚合，而组织内无法聚合，骨髓稀软，无法切片。尤其是含脂肪较多的骨髓更是如此，如固定不及时，细胞可自溶、干涸，染色时细胞核不着色，如同坏死细胞一样成为细胞影子而影响观察。适用于骨髓活检的几种固定剂可根据需要选用。其他组织所用固定剂与常规石蜡制片方法中所用试剂相同。

1.PCF（重铬酸钾-升汞-甲醛）固定剂及配制

甲液:重铬酸钾（pot.dichromate）　　　2.5g

升汞（corrosive sublimate）　　　　　　5g

蒸馏水　　　　　　　　　　　　　　100ml

溶解后棕色瓶室温下保存。

乙液:40%甲醛原液

临用时甲液∶乙液=4∶1混合固定过夜即可。

PCF固定剂为固定骨髓组织首选。可使粒细胞胞质颗粒充分固定，有利于区别粒细胞和单核细胞。对其他细胞的固定效果也较佳。缺点是穿透力弱，固定时间较长，且染色前要脱去汞色素，否则影响观察。

2.中性甲醛固定液

40%甲醛　　　　　　　　　　　　　10ml

磷酸盐缓冲液（pH7.2，0.01mol/L）　90ml

混合后可将pH调至7.2。

附:磷酸盐缓冲液（0.01mol/L，pH7.2±0.2）

磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）　　3.715g

磷酸二氢钾(KH2PO4)　　　　　　　0.43g

氯化钠（NaCl）　　　　　　　　　　　7.2g

蒸馏水　　　　　　　　　　　　　　　1000ml

骨髓活检标本常规固定4h以上。该固定剂优点是渗透力强，固定均匀，组织收缩小，但对粒系细胞颗粒固定效果差。为淋巴组织及其他非造血组织的常规固定剂。中性甲醛固定且石蜡包埋制片的组织标本可行免疫组化和原位杂交检测。

3.2.5%戊二醛固定液

2.5%戊二醛　　　　　　　　　　　　10ml

0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）　　90ml

混合后固定2～3h，此固定剂作用缓慢，对红系细胞胞质及粒细胞胞质固定效果差，不易被酸性染料染色。此为电镜标本常规固定剂。

（二）脱钙

由于骨髓组织中含有骨小梁，所以必须用酸性脱钙剂将骨小梁中的钙盐成分去除，以便浸透液及包埋液充分浸入骨髓组织中，使骨髓组织内外的塑料包埋剂充分、均匀地聚合，从而制备出良好的切片。若不进行脱钙，则因骨小梁内包埋剂浸透不完全，切片易碎裂，质量不佳。

脱钙剂:5%硝酸

浓硝酸　　5ml

蒸馏水　　95ml

脱钙时间:2.5～3.0h弃去脱钙液，蒸馏水洗1次，进入脱水程序。

（三）脱水

脱水是指采用亲水性有机溶剂（如乙醇或丙酮）根据高浓度溶剂向低浓度溶剂中渗透的原理，把组织中原有的水分置换出来，以便疏水性的包埋剂（如石蜡）渗透入组织中去。因塑料包埋剂为亲水性的，故也可不必脱水。尤其是淋巴结、肾穿刺、胃镜标本、脾脏等组织固定后即可浸透、包埋。但骨髓组织含脂肪较多，因此仍以充分固定和脱水后制片效果更好。

脱水程序:80%乙醇40min→95%乙醇40min→100%乙醇Ⅰ40min→100乙醇Ⅱ40min→纯丙酮15min。

（四）浸透

浸透是在包埋前让包埋介质缓慢、均匀地渗透入组织中去，以便在包埋时使组织内外的包埋剂同时凝固或聚合，从而达到内外软硬度一致的目的。如不浸透或浸透不充分，组织中缺乏包埋介质，当包埋剂聚合时组织外的包埋剂凝固聚合，组织内因无包埋剂不能聚合而组织稀软无法切片。浸透液可用HEMA单体，亦可用包埋剂甲液（见后）。

浸透方法:脱水后的组织（软组织可不必脱水）入浸透液（包埋液甲液）Ⅰ2～3h，入浸透液（包埋液甲液）Ⅱ（过夜或12～24h）。

包埋剂及浸透液的配制:

1.甲液

甲基丙烯酸羟乙基酯单体（2-hydroxyethymetacrylate，HEMA）　　　　　　　　　84ml

聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-4006ml

过氧化苯甲酰（benzoyl peroxide）　　　　0.6g

先以少量HEMA混合后充分搅拌，使过氧化苯甲酰完全溶解透明为止，把其余的HEMA混入其中，装入棕色瓶中，4℃保存。可作为浸透液与包埋液用。

2.乙液

PEG-400　　　　　　　　　　　　　　　　15ml

N-N二甲基苯胺（N-N-dimethylaniline）1ml

混合后4℃保存，变色不影响使用。

（五）包埋

1.从浸透液中取出组织标本，用滤纸吸去多余的浸透液后将标本平放入包埋盒底部，同时把标签放入盒壁的一侧，将病理编号面向外。

2.将包埋盒放于托盘中。

3.配包埋液（甲液∶乙液=50∶1），搅拌均匀后立即将包埋液快速加入装有标本的包埋盒内。

4.剪一块保鲜膜将所有的包埋盒盖严，使液面与空气隔离，促进聚合。

5.将装有包埋盒的托盘放入4℃冰箱，待塑料块完全聚合后取出放置室温。

6.用剪刀将包埋盒剪开取出塑料块进行切片。

（六）切片

塑料块取出后，用钢锉磨去包埋块底部（有组织的一侧）多余的塑料，暴露出组织切面，用普通轮转式切片机及切片刀（C型钢刀）切成3μm薄切片放入洁净的凉水面上展平，然后捞至洁净的载玻片上（不需黏附剂），在70～80℃的烤片机上充分烤干（至少2h）。

（七）染色

因塑料薄切片是亲水性的，故可直接染色，不必脱去塑料也不必脱水透明。染毕于烤片机上烤干即可树胶封片。一般石蜡切片可进行的染色方法均可用于塑料切片。

1.苏木素-伊红（HE）染色法

（1）染色方法

①1%碘液5min（脱汞），自来水洗（非PCF或Zenker液固定的组织标本不需此步，以下同）。

②5%的海波液2min（脱碘）。

③Harris苏木素液浸染5～10min，自来水洗。

④1%盐酸乙醇1s立即用自来水冲洗。

⑤2%氨水5s立即用自来水冲洗。

⑥0.5%伊红液浸染10s左右用自来水冲洗。

⑦95%乙醇分化（去除红色背景），用自来水冲洗烤干。

⑧中性树胶封片。

结果:细胞核蓝色，胞质为红色，成熟红细胞为红色。

（2）试剂配制

Harris苏木素

苏木精　　　　　　1g

无水乙醇　　　　　10ml

钾明矾　　　　　　20g

蒸馏水　　　　　　200ml

苏木素溶于乙醇，钾明矾溶于蒸馏水，加温溶解，冷却后两液混合，再加热煮沸1min，速将三角烧瓶放入冷水内冷却，之后将苏木素装入棕色瓶中室温下保存，用前应过滤。每100ml苏木素加6ml冰醋酸。

2.苏木素-姬姆萨-伊红（H-Giemsa-E）染色

（1）染色方法

①1%碘液5min（脱汞），水洗。

②5%海波液2min（脱碘），水洗。

③Harris苏木素5～10min，水洗。

④入稀释的Giemsa液40min，水洗。

⑤0.5%伊红Y液1～2min，水洗。

⑥95%乙醇分化去除组织周围的红色背景，水洗。

⑦再入稀释的Giemsa液迅速浸染，水洗，烤干。

⑧中性树胶封片。

结果:胞核蓝色，胞质颜色层次丰富，原始粒、红系及巨核系细胞胞质浅蓝色。早、中、晚幼等不同发育阶段的粒红系细胞胞质由蓝变为红色，胞质内中性、嗜酸性颗粒清楚。单核细胞胞质淡粉红不见颗粒。此法是骨髓塑料切片最佳染色方法。可用此方法准确区分各系各阶段造血细胞。

（2）试剂配制

①碘液

碘　　　　　　　　　1g

碘化钾　　　　　　　2g

蒸馏水　　　　　　　300ml

②海波

硫代硫酸钠　　　　　5g

蒸馏水　　　　　　　100ml

③伊红Y液

伊红Y　　　　　　　0.5g

95%乙醇　　　　　　100ml

④Giemsa原液

Giemsa粉　　　　　0.5g

甘油　　　　　　　　33ml

甲醇　　　　　　　　33ml

将Giemsa粉放入研钵中，倒入少量甘油，研磨至无颗粒为止，将其余甘油倒入，混匀加热到56℃，90～120min，然后加入甲醇，混匀后放置棕色瓶中数天，过滤后即可使用。此液久染色效果较好。

Giemsa稀释液:

Giemsa原液　　　　　　　　20滴

PBS（pH7.2　0.01mol/L）　50ml

3.网状纤维染色（Gomori法）　主要用于区别肉瘤和癌（即区别间叶组织来源的肿瘤和上皮来源的肿瘤），区别良、恶性血液疾病（如再生障碍性贫血和骨髓增生异常综合征、淋巴瘤侵犯骨髓和淋巴细胞反应性增生等），显示肾小球、血管、上皮基底膜，判定有无骨髓纤维化及其程度等。

（1）染色方法

①染前常规脱汞、脱碘。

②0.5%酸性高锰酸钾液氧化5～10min，水洗。

③2%草酸漂白2min，水洗。

④2%铁明矾水溶液15min，水洗，蒸馏水洗。

⑤氨银液3min，蒸馏水洗。

⑥20%甲醛液还原3min，水洗。

⑦0.2%氯化金30s，水洗。

⑧烤干，中性树胶封片。

结果:网状纤维呈黑色，胶原纤维深黄色或浅褐色，胞核灰褐色，深浅不一。

（2）染液配制:可用网状纤维染色试剂盒，也可自配:

①0.5%高锰酸钾水溶液

高锰酸钾　　　　　　　0.5g

蒸馏水　　　　　　　　100ml

②2%草酸

草酸　　　　　　　　　2g

蒸馏水　　　　　　　　100ml

③2%铁明矾

硫酸铁胺　　　　　　　2g

蒸馏水　　　　　　　　100ml

④氨银液:用小量杯盛入10%硝酸银4份加入10%氢氧化钾1份（出现黑褐色沉淀物），共5份。弃去上清液，加蒸馏水洗涤，反复3次，弃上清液最后加蒸馏水至原来的5份;另取浓氨水不断滴加不断摇荡，直到溶液清亮，沉淀逐渐溶尽尚留有少数细小颗粒时停止滴加浓氨水，再次将10%硝酸银加入几滴使溶液又复浑浊再加几滴浓氨水，使溶液再行变清，最后加1倍体积的蒸馏水便可使用。

4.铁染色　为主要用于显示细胞内和间质三价铁的一种敏感方法。原理为:三价铁离子从蛋白中被稀盐酸分离出来与亚铁氰化钾反应生成蓝色的亚铁氰化铁，即普鲁蓝（Perl’s blue）反应，而后用酸性品红染液复染，使铁色素染成蓝色，细胞染成红色。

（1）染色方法

①染前常规脱汞、脱碘。

②2%亚铁氰化钾水溶液:与2%盐酸水溶液按体积比1∶1混合后滴加在切片上10～20min，水洗。

③0.5%中性红水溶液染胞核5min，水洗。

④烤干，中性树胶封片。

结果:含铁血黄素深蓝色，胞核红色。

（2）染液配制

①Perl液:2%亚铁氰化钾水溶液25ml，2%盐酸水溶液25ml。两液分别贮存，临用时等量混合过滤使用。

②0.5%碱性品红乙醇溶液:碱性品红0.5g,50%乙醇100ml混合。

5.肥大细胞染色（甲苯胺蓝染色）　显示肥大细胞胞质颗粒，肥大细胞颗粒呈异染性，胞质颗粒呈紫红色。

（1）染色方法

①染前常规脱汞，脱碘。

②0.5%甲苯胺蓝液40min，水洗。

③烤干封片。

结果:肥大细胞胞质颗粒呈紫红色。

（2）染液配制

甲苯胺蓝　　　　　0.5g

95%乙醇　　　　　100ml

6.淀粉染色（刚果红染色法）　主要用于淀粉样物质的染色。

（1）染色方法

①染前常规脱汞，脱碘。

②苏木素染色5～10min水洗。

③1%盐酸乙醇分化，水洗。

④1%刚果红30min。

⑤1%碳酸锂15s。

⑥80%乙醇分化至红色不退色为止，流水冲洗。

⑦烤干封片。

结果:淀粉样物质为红色，胞核蓝色。

（2）试剂配制

1%刚果红

刚果红　　　　　　1g

蒸馏水　　　　　　100ml

7.过碘酸雪夫（PAS）染色　主要用于糖原、酸性黏多糖、中性黏多糖、基底膜、脂褐素、脑苷脂、淀粉样物质、软骨、真菌、垂体以及免疫球蛋白的染色。

（1）染色方法

①染前常规脱汞，脱碘（中性甲醛固定不需此步骤）。

②1%过碘酸中氧化10min，蒸馏水洗。

③雪夫试剂10min。

④自来水冲洗10min。

⑤Mayer明矾苏木素染核2min，水洗。

⑥烤干封片。

结果:PAS阳性物质呈玫瑰红或紫红色，胞核蓝色。

（2）试剂配制

①1%过碘酸（pH3～5）

过碘酸　　　　　1g

蒸馏水　　　　　100ml

②雪夫(Schiff)液

碱性复红　　　　1g

偏重亚硫酸钠　　2g

1mol/L盐酸　　　20ml

蒸馏水　　　　　200ml

先将200ml重蒸水煮沸，加入1g碱性复红，再煮沸1min。冷却至50℃后加入20ml浓度为1mol/L盐酸，待35℃时加入2g偏重亚硫酸钠。室温中2h之后见稍带红色，5h后变为无色液体。装棕色瓶中封口，4℃保存。