石蜡包埋制片染色技术

石蜡包埋制片技术是传统的病理制片方法，已有一百多年历史。尽管此方法中常规使用二甲苯透明及脱蜡等，并且浸蜡过程中还需加温60℃以上，对人体的危害和对环境的污染不易避免（现可用不含苯的透明剂产品替代及增加通风设备解决），但石蜡切片可行免疫组织化学染色检测，以及可进行回顾性研究目前是塑料包埋切片所不能替代的。前述塑料包埋切片中所进行的各种染色，同样适用于石蜡包埋切片。

（一）常规石蜡包埋制片技术

1.固定　骨髓活检组织离体后立即固定于10%中性福尔马林（pH7.0）或10%甲醛乙醇（AF）固定液中。固定液量:应为组织体积的4倍以上。固定时间应在4h以上。

固定剂的配制:

①10%中性福尔马林固定液

40%甲醛原液　　　　　　　　　　10ml

PBS溶液*　　　　　　90ml

将二者混合即可。

*磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol/L，pH7.2±0.2）配制:

磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）　　3.715g

磷酸二氢钾(KH2PO4)　　　　　　　　0.43g

氯化钠（NaCl）　　　　　　　　　　　7.2g

蒸馏水　　　　　　　　　　　　　　　1000ml

将3种粉剂放入蒸馏水中溶解，调至pH7.2±0.2。此固定液固定骨髓组织4h以上，尤其适合免疫组化和分子生物学（如多聚酶链反应）检查。

②10%甲醛乙醇（AF）固定液

40%甲醛原液　　　　　　　　　　　10ml

95%乙醇　　　　　　　　　　　　　90ml

将二者混合即可。此固定液固定骨髓组织4h以上，石蜡包埋切片，HGE染色的胞核胞质的形态极佳。

③Bouin固定液

饱和苦味酸水溶液　　　　　　　　　75ml

40%甲醛原液　　　　　　　　　　　25ml

乙酸（冰醋酸）原液　　　　　　　　5ml

将3种试剂混合即可。此固定液固定骨髓组织4h以上，可以不脱钙即进入脱水程序。虽然渗透力极强，但影响红系胞质的染色是其不足。

2.脱钙　骨髓活检石蜡包埋切片必须在脱水前先脱钙，否则伤切片刀及无法切片。脱钙既要考虑到减少对组织抗原的破坏，有利于做免疫组化，又要脱钙充分，保证切片质量。超声脱钙（快速脱钙仪）可能会使骨髓组织中的造血细胞震动脱落，出现增生减低的假象而影响诊断结果，应该探讨。

（1）脱钙液的配制

①5%硝酸脱钙液

浓硝酸　　　　5ml

蒸馏水　　　　95ml

将二者混合即可。蒸馏水也可用4%的甲醛替代，既有固定作用又有脱钙作用。实践证明5%硝酸脱钙液脱钙2～2.5h比2%硝酸脱钙液脱钙2～2.5h更彻底，两者对抗原的破坏无明显差别，5%硝酸脱钙液为常规使用。

②饱和苦味酸脱钙液

苦味酸乙醇饱和液　　　　　　　　　85ml

甲醛　　　　　　　　　　　　　　　10ml

乙酸　　　　　　　　　　　　　　　5ml

将3种试剂混合即可。此种脱钙液也适合骨髓组织的脱钙，不适合进行免疫组化染色。

③EDTA脱钙液(EDTA　乙二胺四乙酸二钠)

EDTA　　　　　　　　　　　　　　　10g

PBS缓冲液（Ph6.8～7.0）　　　　　　100ml

将两者混合即可。为最温和的脱钙液，脱钙时间最长1周左右，对抗原的保存最好，适合行免疫组化染色及分子生物学研究。

（2）脱钙步骤

①弃去固定液，蒸馏水洗1遍，5%硝酸脱钙2～2.5h。

②弃去脱钙液，蒸馏水洗1遍，进入脱水程序。

3.脱水透明　骨髓标本脱水程序:采用梯度乙醇由低到高浓度进行80%乙醇40min→95%乙醇40min×2→无水乙醇40min×2→二甲苯（或其他透明剂）5min×2，进入浸蜡程序。

4.浸蜡　骨髓组织标本经脱水透明后进入融化的石蜡，分两部浸蜡，每步15min，蜡温控制在59～60℃。

5.包埋　将浸过蜡的骨髓组织放入包埋框内居中，倒入融化的蜡液后立即在框边放入标签（病理编号字面向外），待蜡块凝固、冷却后取出。

6.切片　采用轮转式普通切片机，C形刀或一次性刀片。切片厚度3～4μm，将石蜡切片在40℃左右水中展开，平铺于涂过APES（或其他粘片剂）的载玻片上，在烤箱内烤片2h，温度不超过70℃。如急用可用95℃，时间不超过30min，此方法不影响免疫组化染色。

7.苏木素-伊红染色　染色是用染液对组织切片进行处理，是组织中的不同成分被染上相应的颜色，产生不同的折射率，以利于光镜观察和分析。常用的染色术语为普通染色、特殊染色、单一染色、多色染色、对比染色、分化、反蓝等。苏木素-伊红染色是组织制片技术中最常用的染色方法，故称该法为普通染色，又称常规染色，取苏木素(Haematoxylin)和伊红(Eosin)两个英文字头，简称“HE”染色。

（1）试剂配制:苏木素液的配制见本章第一节塑料包埋制片染色技术。苏木素的配方很多，如Harris,Mayer,Gill等配方。最常用的为Harris。

苏木素　　　　　1g

硫酸铝钾　　　　15g

无水乙醇　　　　10ml

红色氧化汞　　　0.5～1g

蒸馏水　　　　　200ml

(2)染色步骤

①烤好的石蜡白片经脱蜡至水，即二甲苯10min×2，无水乙醇5min×2，95%乙醇5min×2，80%乙醇5min。

②入苏木素液3～5min，流水充分洗涤。

③1%盐酸乙醇分化，流水充分洗涤。

④2%氨水返蓝，流水充分洗涤。

⑤0.5%伊红液3～5min，流水充分洗涤。

⑥95%乙醇分化，流水充分洗涤。

⑦95%乙醇5min，无水乙醇5min×2脱水，二甲苯透明5min×2。

⑧封片。于二甲苯挥发完全之前，滴1滴中性树胶于组织切片上，盖片。

(3)结果:胞核呈深蓝色，胞质呈红色。

8.阿尔辛蓝过碘酸雪夫(AB/PAS)染色法

（1)试剂配制

①1%阿尔辛蓝乙酸水溶液

阿尔辛蓝　　　　　　　　　1g

乙酸　　　　　　　　　　　3ml

蒸馏水　　　　　　　　　　97ml

混合即成。

②过碘酸氧化液

过碘酸　　　　　　　　　　1g

蒸馏水　　　　　　　　　　100ml

溶解后4℃保存。

③Schiff液

碱性复红　　　　　　　　　2g

1mol/L盐酸　　　　　　　20ml

偏重亚硫酸钠　　　　　　　1g

重蒸馏水　　　　　　　　　200ml

将200ml蒸馏水煮沸，加入1g碱性复红，再煮沸，冷却后加入20ml浓度为1mol/L盐酸，再加入2g偏重亚硫酸钠。室温中5h后变为无色液体。棕色瓶中4℃保存。

（2)染色步骤

①制备好的石蜡切片脱蜡至水。

②蒸馏水浸洗1min。

③入3%醋酸液中3min。

④入阿尔辛蓝液中30min或更长时间。

⑤入3%醋酸液中3min。

⑥蒸馏水冲洗3次。

⑦0.5%过碘酸氧化10min。

⑧自来水清洗，蒸馏水浸洗2次。

⑨在Schiff液中10～20min。

⑩流水冲洗2min，蒸馏水洗2次。无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

（3）结果:黏液染色呈海蓝色。

9.核仁形成体区（AgNOR）银染色

（1）试剂配制

①50%硝酸银

硝酸银　　　　　　　　　　　　　　　50g

蒸馏水　　　　　　　　　　　　　　100ml

配好后4℃避光保存。

②2%明胶甲酸

白明胶　　　　　　　　　　　　　　2g

1%甲酸　　　　　　　　　　　　　100ml

配好后4℃保存。

（2）染色步骤

①制备好的石蜡切片脱蜡至水。

②切片入新配制的胶体银溶液，避光反应40min。

③去离子水（双蒸水也可）洗去胶体银溶液。

④无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

（3）结果:胞核内核仁形成体呈散在大小不等，多少不等棕褐色颗粒或块状阳性。恶性细胞颗粒大，数量多;良性细胞颗粒小，数量少。

10.六胺银染色

（1）试剂配制

①六胺银原液:3%六次甲基四胺（乌洛托品）水溶液100ml,5%硝酸银水溶液5ml,用时将2种液体混合。

②六胺银染液:六胺银原液25ml，硼砂（四硼酸钠）水溶液2ml，蒸馏水25ml。

③亮绿染液:亮绿0.2g，乙酸0.2ml,蒸馏水100ml。

(2)染色步骤

①制备好的石蜡切片脱蜡至水。

②5%铬酸水溶液氧化1h,然后流水洗5min。

③1%亚硫酸氢钠水溶液5min脱铬，流水洗5min,蒸馏水充分洗涤。

④六胺银染液（45～50℃）1h,蒸馏水充分洗涤。

⑤0.2%氯化金调色3～5min,蒸馏水充分洗涤。

⑥2%硫代硫酸钠水溶液5min，流水洗，蒸馏水洗。

⑦亮绿染液对比染色。

⑧流水洗，95%乙醇、无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

（3）结果:真菌呈黑色，背景绿色。

（二）注意事项

1.固定液的选择　10%AF固定液固定显示细胞核染色质结构（尤其淋巴细胞）优于10%中性福尔马林（pH7.0）;10%中性福尔马林（pH7.0）固定组织做免疫组化优于10%福尔马林液。Bouin固定液因pH低，胞质着色不理想，不利于造血细胞的辨认。

2.骨髓标本脱钙要彻底　脱钙不彻底的骨髓石蜡块不仅切片困难而且石蜡片脱片率很高，严重影响切片质量及免疫组化染色。脱钙液（硝酸）的浓度一般掌握在5%～6%，时间在2～2.5h，以细针穿刺骨髓标本无阻力为宜，如穿刺突破感不佳，则继续延长脱钙时间直至满意为止。一般不需要提高脱钙液浓度。

（方立环　孙福军）