随着近年来流式细胞技术（flow cytometry,FCM）的不断发展和白血病MICM分型的应用，流式细胞免疫分型技术在血液病诊断中的地位越来越重要。白血病细胞本身并未发现具有特殊性抗原，免疫分型的原理是基于白血病细胞的分化阻滞学说，即白血病细胞与正常髓系和淋系细胞相似，会出现某个细胞发育阶段的抗原表达，依据抗原表达谱对白血病进行免疫分型。但由于白血病细胞具有肿瘤细胞的特征，其抗原表达又不完全同于正常造血细胞，常可出现某些缺失表达、过度表达和系列交叉表达，这就增加了白血病免疫分型的复杂性。
流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体（McAb）标记抗原，多参数分析白血病细胞的细胞膜、细胞质或细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。FCM能快速、多参数、客观地定性，又能定量测定细胞膜、质、核的抗原表达。由于流式细胞术可做活细胞免疫标记且自动计数，避免了人工计数时主观因素对结果的影响。尤其是在分析急性未分化白血病双表型或杂合型等表型是免疫组化所不及的。但流式细胞分析免疫表型基本上依据其数量和胞体大小的变化，且不能显示组织结构的变化以及阳性物质在细胞内定位的变化（这在病理诊断尤为重要），尤其在缺乏肿瘤细胞特异性抗原的情况下，有时对少量瘤细胞（如富于T细胞的大B细胞淋巴瘤90%的小细胞是反应性T细胞，大细胞仅10%为瘤细胞），甚至单个瘤细胞（如霍奇金淋巴瘤的诊断性爆米花细胞、RS细胞和HL细胞）来说，流式细胞术无能为力了。因此，两种方法各有所长，可互为补充，以提高血液病诊断水平。
（一）实验方法
1.标本来源及种类 白血病及淋巴瘤免疫分型可适用于多种标本，如外周血、骨髓穿刺液、骨髓活检、淋巴结活检、内镜活检、细针穿刺活检及胸腹水、脑脊液等。
2.标本的保存 样本的完整性和细胞活性与抗凝剂的选择、运输、保存和温度关系密切。理想状态下，标本应在采集后立刻进行处理和染色。短期保存（1h或更短）应在室温(18～22℃)。长时间保存血或骨髓标本以4℃为佳。标本保存的时间取决于标本类型及其保存条件，肝素抗凝的血和骨髓通常可保存至48～72h;EDTA（乙二胺四乙酸,ethylene diamine tetraacetic Acid）抗凝的血和骨髓可保存至12～24h。EDTA的优点是成熟髓系细胞贴壁造成的损失及血小板聚集较小，但细胞散射光特征丢失较肝素标本快。ACD(复方枸橼酸钠注射液)抗凝的血和骨髓可保存至72h，但由于相对大量的ACD会通过改变pH而影响骨髓细胞活性问题，通常不推荐用ACD做骨髓穿刺抗凝剂。
3.标本的制备
（1）血和骨髓:天然的单细胞悬液。当有血凝块时，应用50μm尼龙网过滤，同时进行细胞计数和血涂片以判断靶细胞群体是否仍然存在。
（2）新鲜未固定的瘤组织块:通过机械分离和酶分离方法以获得最大产量的单细胞悬液，同时还要尽量保证细胞结构的完整性和抗原性。大多数淋巴组织用轻柔的机械方法快速分离即可，某些组织由于细胞间连接紧密，须在机械分离的基础上用蛋白水解酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶进行消化。骨髓标本亦可能因骨细胞成分污染而需要酶消化。但使用酶法一定要确认酶的使用没有改变、减弱靶抗原的表达，细胞活性没有显著降低。
（3）石蜡包埋组织:有些耐甲醛的抗原虽然经过中性甲醛固定病理组织学制片过程，其石蜡包埋组织也可切成白片，经过脱蜡进水处理，PBS洗涤，也可制成细胞悬液进行相应抗体标记做流式细胞检测。
4.抗原染色 大多数白血病细胞的抗原表达于细胞膜，目前采用的直标抗体染色方法使得胞膜抗原染色较为简单，经过抗体与标本的孵育、溶血与洗涤三步即可完成。检测胞质内抗原步骤相对复杂，但对于白血病/淋巴瘤分型极为重要，其中TdT、MPO、cCD3及cCD79a均被EGIL推荐为白血病/淋巴瘤诊断的一线抗体。检测胞质内抗原需要使用破膜剂来实现，使单抗能进入细胞内但又不破坏细胞结构的完整性。在进行膜内外双染过程中，注意对胞膜抗原要保证荧光素不被破膜剂损坏，对胞质内抗体则要保证荧光素分子足够小而能够进入细胞内与胞质内抗原结合。一般说来，先进行细胞膜抗原染色，然后固定和破膜并标记胞质内抗原。
5.荧光标记抗体的选择 血液系统恶性肿瘤的复杂性使多色分析明显优于单色分析，传统的单色分析不再是常规方法。现在国际上一致推荐白血病/淋巴瘤免疫分型的最少标记5个参数，包括FSC、SSC和CD453个荧光参数，其中必不可少的一个荧光参数为CD45,用以与SSC联合进行设置。选择抗体组合的基本原则如下。
（1）所选的抗体组合应足够广谱，可以鉴别样本中所有细胞亚群（包括正常和异常群体）。由于肿瘤细胞具有抗原表达缺失、过度及交叉的特点，所以多系别抗原标记的选择是必要的。抗体的数量越多，检测的灵敏度越高。
（2）抗体的选择应可以区分正常和异常细胞，将正常细胞作为实验的内参照，使得异常细胞的表达更为清晰。现用的CD45/SSC设门法即可达到此要求。
（3）荧光强度和表位密度应同时考虑。对表达少的抗原表位应尽可能选择染色亮度强的荧光素。
（4）实验人员应了解所用抗体的细胞反应谱，以及与特定荧光素结合后的染色模式，相同CD编号的不同抗体可能有不同的结合模式。
（5）免疫分型组合方案
①大而全的抗体组合：全面了解抗原表达，无需额外染色，省时但费用高。
②先进行一线抗体染色，再根据所得信息采用第二线特异性更高的抗体组，虽经济，但费时。
③选用有目标性的抗体组合以确认可疑的诊断或分类，相比之下既经济又省时，但需要临床或形态学的资料，这要求实验室与临床能够紧密合作，或实验人员本身具备临床知识。
6.结果分析 通常每个标本应获取（1～2）×104个有核细胞的荧光和散射光信号，微小残留病分析则需要至少1×105个细胞，分析细胞的数量不同，决定检测的敏感性不同。恶性细胞常有大小和粒度的异质性，获取时最好收集无门的数据以保留所有未知异常细胞群体的所有特性。骨髓分析时散射光最好用对数放大，这样不会让大细胞如骨髓瘤细胞跑出界外。用线性放大时需要调节不同的增益以保证异常细胞都被检测到。FSC和SSC信号都可以用来作为阈值设定的参数，选择关键在于哪个参数能更明显地区分有核细胞和碎片。
首先分析所有细胞的抗原表达情况，鉴别出正常细胞和异常细胞群体，正常细胞的表现可以作为整个实验染色过程的内部参照，提供实验一致性与否的客观证据，异常细胞则通过进一步设门分析确定表型特点。近年来主张用CD45/SSC（侧向角散射）设门方法，即用CD45与SSC取样后将骨髓细胞清晰地分出淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、幼稚细胞及有核红细胞群。其理论依据是CD45是所有白细胞的抗原，其表达强度在淋巴细胞最高，单核细胞、粒细胞、原始细胞（blast）依次减弱。红细胞（幼稚及成熟红细胞）、血小板不表达CD45。SSC反映细胞的颗粒性，成熟粒细胞SSC最高，依次为单核细胞、淋巴细胞、原始细胞、红细胞。CD45/SSC设门法同时加上2个或3个荧光标记的单抗，很容易识别非正常细胞群所表达的抗原，在幼稚细胞比例低的情况下或检测残留白血病时尤为重要。
虽然对流式免疫分型结果的解释最好与形态学结果综合考虑，但流式细胞术的作用远远大于对形态学结果的简单证实，其既可以帮助形态学确认某些诊断，也可以提出不同的疾病诊断，但应尽量解释任何流式结果与其他方法结果上的不一致。流式结果应与临床、形态学、细胞遗传等其他方法综合考虑。
在结果分析中，应注意定性的描述（阳性或阴性）通常要比阳性百分率的计算更有价值。百分率可用于描述异常和正常细胞群所占的比例。只有在设门内细胞全部是感兴趣的细胞，而且荧光分布的形状可以非常清楚地区分阳性和阴性亚群的情况下，阳性细胞百分率才有意义。当然，在某些抗原异质表达的群体中，可进行定性或定量的分析。
评估抗原表达强度是分析的重要组成部分。对于一个特异的抗体而言，荧光强度是抗原密度的反映。某些情况下是根据抗原的表达过度、缺失或交叉现象确认异常细胞群体，但有时只能从抗原表达的异常强度来判断。如用一些髓系抗原CD14、CD33、CD64的相对表达强度和散射光特征一起来确认单核细胞系和粒细胞系的发育成熟过程。荧光强度的评估在大多数情况下可以采用定性的资料，但由于试剂和机器条件的不同，最好以其在相同条件下相对正常细胞的强度来表示。如CD45、CD8或CD38等在不同细胞上的表达密度相差几个对数范围，而CD22或CD4等抗原在所谓阳性范围内在不同细胞类型上的差别较小。
区分弱阳性和阴性群体，在某些情况下对诊断有较大的价值，如B淋巴细胞增殖性疾病中的sIgM弱表达，但弱表达的判断却常常很难，易受人为因素影响。可通过选用强的荧光染料，或用过量未标的抗体阻断非特异染色，从而判断弱阳性染色的特异与否。
（二）临床意义
骨髓细胞的形态学分型是白血病分型的基础，而免疫分型是对形态学分型的重要补充和确认。国际白血病MIC分型协作组认为免疫分型对下列情况意义更大:①淋系与髓系的区分;②AML-M0、AML-M7和AUL的诊断;③急、慢性淋巴细胞白血病亚型的分类;④杂合型白血病。此外，免疫分型在判断预后、提示细胞遗传学异常及微小残留病检测方面亦有重要意义。
（杨晴英 王慧君）
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