（一）基本原理
透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）简称透射电镜，它是用电子束代替光束，由于电子束波长远低于光的波长，而分辨率与波长有关（波长越短，分辨率越高），因此电镜的分辨率比普通光学显微镜高出1000多倍。电镜所用的电子束是在高电压（40k～100kV）中产生，在高真空中运行，部分电子直接穿过样品，形成透射电子及散射电子。因为样品结构含有不同成分，透射电子数及散射电子数也不同，透射电子多的地方，透过的电子多，在荧光屏上形成的光强，表现为亮区，散射电子多的地方，透过的电子少，在荧光屏上形成的光弱，表现为暗区，从而形成电子密度深浅不一的图像。由于电子束的穿透力很弱，所以观察的生物标本必须很薄，一般不超过50nm。
（二）实验步骤
取材→固定→脱水→浸透→包埋→切片→染色。
1.取材
（1）取骨髓穿刺液或外周血1～4ml（根据外周血中白血病数量确定取材量，白细胞数越多所需用量越少），轻轻打入肝素抗凝剂管内，混匀4～5次。
（2）用吸管吸出骨髓液或外周血置于等量的淋巴细胞分离液上部，于直角离心机离心10min（1000～1200r/min）。
（3）用吸管吸出淋巴细胞液和血浆之间的有核细胞层，放入1.5ml的Ep管内，同时吸出0.5ml的血浆与细胞混匀，用台式离心机或直角离心机离心5min（1500r/min）。
2.固定
（1）常用固定剂
戊二醛（glutaraldehyde，C5H8O2），固定速度快，穿透力强，对蛋白质、微管、糖原、膜性结构保存好。可保存细胞内某些酶的活性，有利于细胞化学研究。缺点是无电子染色作用，不能增加图像反差。对脂类不起固定作用。
市售戊二醛为25%或50%水溶液，pH4.0～5.0，当pH在3.5以下不能使用，须用活性炭提纯以除去杂质。保存条件4℃，常用浓度2.5%～6%。
锇酸（osmium tetroxide，OsO4），又称四氧化锇，淡黄色结晶状，一般密封在玻璃安瓿内，对黏膜有毒性作用，是一种强氧化剂。
优点:对氮有极大的亲和力，能与各种氨基酸、蛋白质交联。固定脂类，保护脂肪，与不饱和脂肪酸链结合，形成脂肪-锇复合物，它是唯一能固定脂类的固定剂;与细胞内各种化学成分结合。不使组织收缩、变形，保存细胞原有形态;具有电子染色作用，这是由于锇酸属金属离子化合物，密度高，受电子轰击时，散射电子能力强，可以提高图像的反差。
缺点:对糖原保存效果差;不与核酸反应;固定时间一般1～2h，不能超过4h，时间长则组织易变脆;由于分子量大、渗透力弱，不能迅速进入组织内部，因此要求组织块体积不超过1mm3，否则其内部得不到充分固定;是酶的钝化剂，使酶的活性减弱或消失，不利于细胞化学研究;毒性大，对眼、口腔、鼻、喉黏膜毒性大，应在通风厨内操作。
（2）固定方法
①前固定:弃去有核细胞上部的血浆，沿管壁轻轻加入2.5%戊二醛固定剂固定30min（4℃）。用牙签挑出细胞团块，用刀片将其切成1mm3，放入Ep管内继续固定1.5h，换0.1mol/L磷酸缓冲液2次，4℃保存。
②后固定:1%锇酸固定2h，双蒸水洗2次。
3.脱水 常用脱水剂为丙酮和乙醇。脱水步骤30%、70%、90%乙醇或丙酮10～15min，100%乙醇或丙酮2次，每次10～15min。
由于乙醇与环氧树脂不能相互混溶，故而乙醇脱水时需用环氧丙烷过渡2次，每次10～15min。夏季湿度大时，100%乙醇或丙酮阶段宜在干燥箱或置于干燥剂（硅胶）中进行,以免脱水不彻底。
4.浸透
环氧丙烷:纯包埋液=1∶1，1～2h;纯包埋液浸透2～3h，每隔30～40min搅动一次。
5.包埋
（1）常用包埋剂:环氧树脂Epon 812是一种性能优良的包埋介质。其特性是黏度低，收缩率小，聚合均匀，不形成气泡，在电子束轰击下切片十分稳定。缺点是吸湿性大，注意防潮。因具有毒性，应在通风橱中进行并避免皮肤接触。实际应用时应加入增韧剂DDSA（十二烷基琥珀酸酐）、固化剂MNA（甲基内次甲基四氢苯二甲酸酐）、加速剂DMP-30（2，4，6-二甲氨基苯酚）。
（2）包埋方法:骨髓及外周血细胞包埋常采用胶囊法。将胶囊插入废旧96孔板中，把写好的标签，卷成环放入胶囊内，向胶囊中滴入包埋液，用牙签将标本块挑至胶囊中心，使其自然降至底部，放入烤箱内聚合，40℃过夜，60℃24h;或者直接进入60℃烤40h。
6.切片
（1）切片:将标本块和刀安装好，一定要夹紧，防止产生振颤。开机后用粗调将刀与标本块调至合适位置后，把厚度标尺放在70～80nm处，速度为2mm/s或5mm/s，然后厚度慢慢减薄至50nm，可见切片为银白色或淡黄色，直至获得足够的切片。打开切片机上的风扇冷却标本臂，5min后关闭。
(2）捞片:用睫毛做成的针把漂浮在水面上的切片带，或者把散开的切片聚在一起，用镊子夹住载网的边缘，膜面向上，以40°角入水，将切片拨至载网上方，慢慢提起载网，即常说的打捞，此法能获得平整的片子。还可以采用扣网法捞片，即将载网支持膜向下，与切片轻轻接触，使之贴附在支持膜上，此法捞片容易，但易产生皱折，影响观察。也可以用不做膜的铜网直接捞片，但切片要足够大，一张铜网上需4～6张切片。
7.染色 将蜡块溶化后倒入直径为10～12cm的平皿内制成蜡盘，按需要把装载网的标本盒切成可以装20～25张片子大小，上部，底部钻孔，并在蜡盘中挖出与之大小一致的槽。
染色步骤:
（1）将载网装入用于染色的标本盒内，放在蜡槽内，滴入铀染液，室温25℃染色20min，温度太低时应加热。
（2）双蒸水冲洗。
（3）用滤纸洗干水分，加入铅染液，为防止形成沉淀，放入少量的氢氧化钠颗粒于蜡盘上，室温染色5～10min。
（4）双蒸水冲洗，晾干。如果载网数量比较少，可以采用滴染的方法，具体操作方法是:
将染液直接滴于蜡盘上，用镊子夹住载网的边缘，有片子的一面与染液接触，醋酸铀染色20min，取2个100ml小烧杯，装入双蒸水，用镊子夹住载网膜边缘，分别在2个烧杯中上下移动镊子洗载网20～30次，然后用滤纸吸干水分，铅染色后也用同样的方法洗去染液。一次滴染的片子数量不要太多，6张以内的数量比较合适，多了易脏。
8.结果 电镜下的超薄切片是由一定孔数的铜网载着，切片应是平整光滑，细胞结构清晰，无震颤、无刀痕、无污物（铀染液和铅染液的沉淀物）。电镜观察的超薄切片，每张片厚度按50nm计算，一个7μm的细胞就要切片100余张，因此，所观察的100张片子的细胞实际上是一个细胞的连续切片。这就要求切片应足够大，以保证观察足够多的细胞。
9.注意事项
（1）透射电镜标本制作繁琐而复杂，要求制作者有高度责任心，足够的耐心和细心。
（2）生物样品要经过固定、脱水、包埋等多种步骤，必定给生物样品造成一定损伤，观察时应考虑这一点。
（3）电镜样品体积小，观察范围小，因此要科学地判断观察结果。
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