(一)髓过氧化物酶(myeloproxidase,MPO)
1.原理 过氧化酶分解底物中的H2O2,释放出的[O]与捕捉物反应,捕捉物是四盐酸3,3-二氨基联苯胺(DAB),DAB很容易被氧化聚合,生成嗜锇性很强的聚合体,经锇酸固定后电子密度很高,称锇黑。
2.实验步骤
(1)与透射电镜标本取材(1)和(2)相同。
(2)用吸管吸出淋巴细胞液和血浆之间的有核细胞层放置于1.5ml的Ep管内,加入生理盐水洗涤1次后,于直角离心机离心5min(1000~1200r/min)。
(3)弃去生理盐水,保留Ep管底部细胞团块,加入1ml孵育液与之混匀,移至棕色西林瓶中,放37℃摇床中孵育20~30min。或经F4G0.1固定液固定20min(4℃)后,Ringer/Tris缓冲液冲洗2次,再进入孵育液。
孵育液配方(用前现配):
DAB 5mg
Ringer/Tris缓冲液 5ml
3%H2O2 100μl
用1NNaOH调pH至7.6。
Ringer/Tris缓冲液配方(4℃):
Tris 3g
NaCl 9g
KCl 42mg
CaCl2 250mg
加双蒸水至1000ml。
(4)从棕色瓶中吸出孵育液置于1.5ml的Ep管内,1000~1200r/min离心5min,弃上清液,保留Ep管底部细胞团块,加入0.5ml血浆混匀,再离心5min[(1000~1200)r/min],弃血浆,加2.5%戊二醛固定2h(4℃),0.1mol/L磷酸缓冲液2次。
(5)1%锇酸固定30min。
(6)常规包埋、切片,不进行电子染色,在电镜下观察结果。
3.结果分析 髓过氧化物酶主要位于粒细胞和单核细胞的核膜、内质网、高尔基体和胞质颗粒中。淋巴细胞为阴性。幼稚粒细胞的早期尚无颗粒时,可在核膜、内质网上发现其阳性产物,此时在光镜下则难以辨别出来,因此电镜MPO结果有利于急性白血病的鉴别诊断。
(二)血小板过氧化物酶(platelet peroxidase,PPO)
1.原理 其原理类似MPO,但该酶与MPO不同之处在于PPO对醛类固定剂的敏感性较MPO强,很容易被戊二醛抑制,MPO则有一定耐受性。PPO主要分布于巨核细胞和血小板中,MPO主要分布于粒细胞和单核细胞中。
2.实验步骤 由于戊二醛对PPO有明显抑制作用,我们实验室多采用不固定细胞就给予孵育的方法,实验结果比较理想。具体操作为:
(1)取材与髓过氧化物酶相同。
(2)将未固定之细胞直接加入孵育液中,放37℃摇床中孵育60~90min。
(3)收集细胞同髓过氧化物酶实验,2.5%戊二醛固定剂固定2h(4℃)。
(4)0.1M磷酸缓冲液2次。
(5)1%锇酸固定30min。
(6)常规包埋、切片,不经电子染色,在电镜下观察结果。
孵育液配方(用前现配)
DAB 10mg
Ringer/Tris缓冲液 5ml
3%过氧化氢溶液 120μl
用1mol/L NaOH调pH至7.6。
(7)电镜常规脱水,包埋、切片,不用铅铀染色,电镜观察。
3.结果分析 PPO定位于巨核细胞的核膜、内质网上,不出现于巨核细胞的高尔基体和颗粒中,还定位于血小板致密管道系统,它出现在早期巨核细胞的祖细胞中,并一直伴随于巨核细胞发育的始终,是诊断巨核细胞白血病最有价值的指标。
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