酯酶双染色

在同一张涂片标本上进行血细胞的两种酯酶染色的方法称为酯酶双染色法。这类方法可在镜下同时观察两种不同的白血病细胞，因此在白血病分类的诊断和鉴别诊断方面酯酶双染色明显优于单项染色。现介绍两种实用的酯酶双染色法。

（一）α-醋酸萘酚酯酶与氯醋酸AS-D萘酚酯酶双染色

【原理】　单核细胞酯酶能水解α-醋酸萘酚，产生α-萘酚，再与六偶氮副品红偶联，在胞质中形成红色颗粒；粒细胞酯酶能水解氯醋酸AS-D萘酚，释放出萘酚AS-D，再与坚固蓝B（B盐）偶联，形成蓝色颗粒，定位于酶的活性在胞质中的部位。

【试剂】

1.固定液 甲醛-丙酮缓冲液（pH6.6，见氯醋酸AS-D萘酚醋酶染色）。

2.温育液 ①甲液：将α-醋酸萘酚10mg加入乙二醇单甲醚0.5ml中溶解，再与0.067mol/L磷酸缓冲液（pH 7.6）8.9ml、六偶氮副品红溶液0.6ml混匀，用lmol/L氢氧化钠调节pH值至6.1～6.5。②乙液：将氯醋酸AS-D萘酚1mg溶解于N，N-二甲基甲酰胺0.5ml中，再与0.067mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）9.5ml、坚固蓝B（B盐）5mg溶解混匀。

3.复染液 2%甲绿溶液。

【操作方法】

1.新鲜干燥涂片标本用甲醛-丙酮缓冲液固定30s，流水冲洗，晾干。

2.置于温育液甲液中10min，流水冲洗，晾干。

3.放入温育液乙液中10min，流水冲洗，晾干。

4.2%甲绿溶液复染5min，流水冲洗，晾干后镜检。

【结果】　阳性反应：α-醋酸萘酚酯酶呈红色颗粒；氯醋酸AS-D萘酚酯酶呈蓝色颗粒定位于胞质中。

（二）α-丁酸萘酚酯酶和氯醋酸AS-D萘酚酯酶双染色

【原理】　α-丁酸萘酚在单核细胞酯酶作用下，产生α-萘酚，再与六偶氮副品红溶液发生偶联反应，形成红色颗粒；氯醋酸AS-D萘酚在粒细胞酯酶作用下，释放出萘酚AS-D，再与坚固蓝B（B盐）发生偶联反应，形成蓝色颗粒，均定位于胞质中。

【试剂】

1.固定液 甲醛-丙酮缓冲液（pH6.6）。

2.温育液 ①甲液：将氯醋酸AS-D萘酚4mg溶于N，N-二甲基酰胺0.5ml中，再与0.1mol/L磷酸缓冲液（pH8.0）9.5ml、坚固蓝B（B盐）10mg溶解混匀后过滤备用；②乙液：将α-丁酸萘酚0.0lml溶于丙酮0.5ml，再与0.1mol/L磷酸缓冲液（pH8.0）9.5ml、六偶氮副品红溶液0.1ml混匀后过滤备用。

3.复染液 苏木精染液或2%甲绿溶液。

【操作方法】

1.新鲜干燥涂片标本在4～10℃甲醛-丙酮缓冲液中冷固定30s，流水冲洗后晾干。

2.置于温育液甲液37℃水浴箱中作用20～30min，流水冲洗，晾干。

3.放入温育液乙液37℃水浴箱中作用30min，流水冲洗，晾干。

4.苏木精溶液或2%甲绿水溶液复染2min流水冲洗，晾干后镜检。

【结果】　阳性反应：氯醋酸AS-D萘酚酯酶呈蓝色颗粒反应；α-丁酸萘酚酯酶呈红色颗粒反应，均定位于胞质之中。

【临床意义】

1.急性粒细胞白血病 NAS-DCE在Ml～M3呈现不同强度的阳性反应，以M3最强，一部分ml的原始粒细胞可呈阴性反应，α-NBE也呈阴性反应。而α-NAE有部分阳性颗粒，故NAS-DCE和α-NBE双染色特异性高于α-NAE和NAS-DCE双染色。

2.急性单核细胞白血病 α-NBE呈阳性至强阳性反应，NAS-DCE呈阴性反应，有利于M5与其他AML的鉴别诊断。

3.急性粒-单核细胞白血病 同一张涂片标本上分别可见NAS-DCE和α-NBE阳性反应的细胞，部分病例甚至可以在同一个细胞内同时呈NAS-DCE和α-NBE双重酯酶阳性反应。因此，酯酶双染色的阳性反应对M4的诊断具有独特价值。

4.急性淋巴细胞白血病 NAS-DCE及α-NBE均呈阴性反应。

【注意事项】

1.骨髓涂片和血涂片应新鲜。

2.每加一种试剂，都要充分混匀。