【原理】 受检骨髓或血液经过分离获得的单个核细胞在粒细胞-单核细胞系集落刺激因子（GM-CSF）作用下，在体外半固体琼脂培养基上形成由不同成熟阶段的粒细胞和单核细胞组成的细胞集落。每个集落可视为由一个粒细胞-单核细胞系祖细胞增殖、分化而来的。因此集落数的多少可以反映造血细胞中粒细胞-单核细胞系祖细胞的量。
【准备】
1.IMDM培养液。
2.淋巴细胞分离液（Ficoll，1.007g/L）。
3.琼脂（3g/L）。
4.小牛血清（56℃30min灭活补体）。
5.GM-CSF。
6.培养皿（直径35mm）。
【操作】
1.制备细胞悬液 取0.2%肝素抗凝骨髓或血液2ml，用IMDM培养液1:1稀释，沿管壁加入含3ml Ficoll的离心管中，1 500r/min离心20min。吸取单个核细胞（MNC）层，用IMDM培养液洗涤两遍，最后计数MNC，配制成2×105/ml MNC悬液备用。
2.琼脂 煮沸琼脂使其完全溶解，于40℃左右水浴中保温备用。
3.配制培养体系 按顺序分别加入小牛血清0.66ml，培养液1.65ml，GM-CSF（终浓度50μg/L），细胞悬液0.33ml充分混匀，置37℃水浴保温10～20min。
4.加入保温的3%琼脂0.33ml，立即充分混匀，每皿接种lml，并均匀铺平，重复三皿。
5.冷却凝固后，置37℃，5%CO2，饱和湿度培养7～10d。
【结果】 培养7d后，将培养皿置于倒置光显微镜下观察。琼脂半固体上大于40个细胞以上的细胞团称为集落（colony），小于40个的细胞团称为簇。一般3～15个细胞团称为小簇、16～40个细胞团为大簇。
【参考值】
骨髓：CFU-GM 150.6±58.4个/2×105 MNC，细胞簇与集落之比为5～20:1。
外周血：CFU-GM集落数为骨髓的1/10。
脐血：CFU-GM 48±6个/2×105 MNC。
【临床意义】 CFU-GM在急性粒细胞白血病中有四种生长类型：不生长型、小细胞簇型、大细胞簇型及集落型，小细胞簇型缓解率较高，而大细胞簇型和不生长型的缓解率较低。CFU-GM减少常见于再生障碍性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）、急性白血病、慢性粒细胞白血病急性变、骨髓纤维化及骨髓增生异常综合征（MDS）；CFU-GM增加见于慢性粒细胞白血病（CML）及缺铁性贫血部分患者。
【注意事项】 严格无菌操作，避免污染。培养体系中加入琼脂的温度要适中，过高会损伤细胞，过低会快速凝固而使细胞不易分散。培养用所有器皿必须符合培养要求。GM-CSF应避免反复冻融而使其活性降低。计数集落时必须依次进行，培养皿四周的集落分布相对较多，计数时应注意。
（二）红系祖细胞（BFU-E、CFU-E）培养
【原理】 在培养体系中加入适量的红细胞生成素（EPO），使骨髓中造血细胞在半固体培养基上形成由红细胞组成的集落（BFU-E和CFU-E）。每个集落可视为一个红系祖细胞增殖分化而来，因此集落的多少可反映造血细胞中红系祖细胞的量。
【准备】
1.IMDM培养液。
2.胎牛血清。
3.10%牛血清白蛋白（BSA） 用IMDM培养液配制。
4.植物血凝素-淋巴细胞条件培养液（PHA-LCM）。
5.2-巯基乙醇（2-ME，103 mol/L）。
6.EPO（100U/ml）。
7.27g/L甲基纤维素。
8.培养皿（直径35mm）。
【操作】
1.制备细胞悬液（同CFU-GM培养）。
2.制备培养体系按顺序分别加入胎牛血清0.66ml，BSA 0.33ml，PHA-LCM 0.33ml，2-ME 0.01ml，细胞悬液0.33ml，EPO 0.066ml，甲基纤维素1.1ml，最后用IMDM培养液补足至3.3ml，充分混匀后加入培养皿中，每皿lml，使均匀分布，重复三皿。
3.将培养皿置于37℃，5%CO2，饱和湿度培养7～14d。
【结果】 CFU-E集落为8～50个细胞组成的细胞团，培养7d计数；BFU-E集落为50个以上细胞组成的细胞团，大的集落每个可由成百至上万个细胞组成，形似烟火礼花，故又称爆式集落（burst forming unit-erythroid，BFU-E），培养14d计数。红系集落在倒置光显微镜下的特点与粒系集落不同，红系集落的背景稍暗、细胞圆整、体积较小，因为细胞质内有血红蛋白的合成，集落可呈暗黄色，可用过氧化物酶染色来鉴定红系集落的存在。
【参考值】
骨髓：BFU-E 25.3±7.6个/2×105 MNC。
CFU-E 141.6±68.4个/2×105 MNC。【临床意义】 BFU-E或CFU-E减少见于再生障碍性贫血、单纯红细胞性再生障碍性贫血、急性白血病（AML和ALL更明显）、慢性粒细胞白血病急性病变及铁粒幼细胞性贫血等；BFU-E或CFU-E增加见于真性红细胞增多症、原发性骨髓纤维化及部分慢性粒细胞白血病患者。
【注意事项】 培养体系应充分混匀，使细胞散在分布后接种于培养皿。重组人EPO溶解后需及时分装，避免反复冻融而使活性降低。观察结果时应避免甲基纤维素干涸而影响集落观察，可在培养物上加一些培养液。
（大连医科大学 荆 源）
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