中性粒细胞趋化功能检测

（一）琼脂糖胶板法

【原理】　在趋化因子的吸引下，中性粒细胞向趋化因子做定向移动。根据其在琼脂糖胶板下移动的距离可判定其趋化功能。

【试剂】

1.中性粒细胞趋化因子有以下两种制法

（1）大肠杆菌培养液：将大肠埃希菌（E.coli）接种于199培养基中，35℃培养过夜。2 000 r/min离心5min，取上清，用lmol/L NaOH调节pH至中性。用时用199培养基做1:5稀释。

（2）酵母多糖活化人血清：新鲜混合人血清5ml，加入PBS洗过3次的酵母多糖50mg，置37℃水浴1h，时时振荡混匀。2 000r/min离心20min后取上清。用时以199培养基做1:10稀释。

2.白细胞悬液 肝素抗凝血加入等容积60g/L右旋糖酐（dextran，分子量15万）或30g/L明胶（右旋糖酐或明胶均用生理盐水配制），混匀后静置20～30min，吸取血浆层，1 000r/min离心10min，弃上清。用8.3g/L NH4Cl低渗，破坏残留红细胞。离心弃上清，用199培养基或RPMI 1640培养基洗沉积白细胞2次，并用此培养基配成2.5×107细胞/ml。

3.15g/L琼脂糖 优质琼脂糖粉1.5g加重蒸馏水100ml，煮沸融解。分装后113℃15min灭菌。

【操作方法】

1.融化琼脂糖胶液，水浴冷却至56℃。加等量两倍浓缩的199或RPMI 1640培养基（预温至56℃）和灭活小牛血清（最终浓度为10%）及适量青、链霉素，混匀。

2.在每块载玻片上浇注上述胶液3ml，置4℃30min充分凝固。每份样本用直径3mm铜管打孔3个，按上、中、下排列。孔距2mm。

3.上孔加趋化因子，中孔加白细胞悬液，下孔加对照培养基（199或1640）。加样量均为10μl。

4.将玻片置于湿盒内，5%CO2的环境（可用烛缸）37℃温育3h。

5.将玻片浸于甲醇中30min，剥除胶膜，用姬姆萨（Giemsa）染液染色10min，镜检。

6.结果判断 测微器（40×）观察，细胞向上孔移动距离（mm）称为趋化运动距离（A），而细胞向下孔（培养基）移动距离（B）称随机运动距离。A/B的比值即趋化指数。每份样本可设2～3组复孔，取均值。

【正常参考值】　因试验条件不同，可有较大差别。进行此项试验时应检查一定数量的正常人，得出正常对照值。一般新生儿趋化指数为2.0～2.5；成人为3.0～3.5。

【注意事项】

1.应通过预试验选择趋化因子和白细胞的最适浓度。

2.浇注琼脂糖胶板时应在水平台面上进行，以保持胶板厚度均匀。

3.孔径、孔距及加样量严格标准化。

（二）滤膜法

【原理】　于Boyden趋化室上室内置白细胞悬液，下室内置趋化因子，中间隔以滤膜。白细胞受趋化因子吸引，从上室通过滤膜进入下室。检测下室的白细胞数，即可判断患者白细胞的趋化功能。

【试剂】

1.趋化因子、白细胞悬液，制备方法同琼脂糖胶板法。

2.培养基199培养基、RPMI l640培养基、Eagle培养基、5.0g/L乳蛋白水解物均可使用。是否含有小牛血清或AB型人血清对结果无影响。

3.趋化室用有机玻璃制作。分上、下两室，上室直径5.5mm，位于螺旋塞正中，下室为直径5.5mm、深8mm的圆形小室，有两条直径4.5mm孔道和外界相通。

4.滤膜混合纤维素酯滤膜，直径13mm，孔径3～5μm。

【操作方法】

1.取直径13mm正中有5.5mm小孔的滤纸片，于其上重叠一张滤膜，置趋化室两室之间。

2.拧紧螺旋塞，压紧滤膜，从外侧孔向下室内加入趋化因子至满，同时设培养基对照（用另一趋化室），封闭小孔。取0.3ml白细胞悬液加入上室。

3.将趋化室置湿盒内37℃温育2h。取出滤膜，置丙醇或甲醇中固定，苏木精染色15min，蒸馏水漂洗，再依次于70%、90%、100%异丙醇中脱水，每种浓度脱水3～5min。最后于二甲苯中透明。

4.透明后滤膜原来向下的一面朝上，贴于洁净载玻片上，油镜下观察。

5.结果判断所用滤膜孔径为3μm时，滤膜面向上室的一面为淋巴细胞与单核细胞。而面向下室的一面只含有移动过来的中性粒细胞。计算5个高倍视野中性粒细胞数。

【正常参考值】　在试验方法建立并稳定后，检测一定数量的正常人，以其结果作为正常参考值。

【临床意义】　白细胞趋化功能缺陷见于Chediak-Higashi综合征、肌动蛋白功能不全症、膜糖蛋白缺陷症、迟钝白细胞综合征、先天性鱼鳞癣、高lgE综合征、糖尿病、烧伤、新生儿等。

【注意事项】

1.正式试验前需先通过预试验选择最适白细胞浓度和趋化因子浓度。

2.在测量结果时应固定采用一种计数方法（滤膜下表面计数或滤膜内计数）。