的分型检测技术

上述传统的HLA分型方法有许多不足之处，近年来国内外已将HLA分型技术由抗原抗体水平发展到基因水平检测。况且以DNA为基础的HLA分型具有诸多优点：①分型检测中使用的寡核苷酸试剂是合成DNA，标准化程度高、来源不受限；②一旦新的等位基因被发现，可设计探针来鉴定；③试验取材少，只需要0.2～0.5ml全血来抽提DNA，而血清学方法需要约10ml，且要求活的淋巴细胞；④DNA分型可检出所有等位基因，血清学方法显然不可能。

（一）限制性片段长度多态性检测技术

这是早期建立的对多态性进行检测的DNA分型技术。个体间抗原特异性来自氨基酸顺序的差别，后者由编码基因的碱基顺序不同所决定。这种碱基顺序的差别造成限制性内切酶识别位置及酶切位点数目的不同，从而产生数量和长度不一的DNA酶切片段。用特异性探针对整个基因组DNA酶切片段进行杂交，即可分析限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）。一定的内切酶组合所得到的HLA-RFLP可以和传统方法测定的HLA特异性型别相关。20世纪80年代末期发展起来的聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术已被用于RFLP分析，即用等位特异限制酶裂解PCR扩增的片段，然后再进行分析，从而大大提高了灵敏度。

（二）PCR/SSO技术

此法乃用人工合成的HLA型别特异的寡核苷酸序列作为探针，与待检细胞经PCR扩增的HLA基因片段杂交，从而确定HLA型别，PCR技术可将HLA复合体上指定基因片段特异性地扩增5～6个数量级；而专门设计的序列特异的寡核苷酸（sequence specific oligonucleotide SSO）探针又能探测出等位基因间1～2个核苷酸的差异，故PCR/SSO技术具有灵敏度高、特异性强、需样本量少等优点。

（三）PCR/SSP技术

目前各检测中心常规应用的HLA-DNA分型技术，具有快速高效的特点，使用序列特异性引物（SSP）特异性地扩增HLA基因，通过凝胶电泳技术检测PCR产物，从而判断HLA基因型。该方法设计出一整套等位基因组特异性引物（sequence specific primer，SSP），借助PCR技术获得HLA型别特异的扩增产物，可通过电泳直接分析带型决定HLA型别，从而大大简化了实验步骤。

由于传统方法在Ⅱ类抗原分型方面困难较大，故上述几种基因分型方法目前主要用于Ⅱ类基因座。此外，目前已经建立的HLA基因分型检测技术还包括PCR单链构象多态性分析（PCR-single strand conformational polymorphism，PCR-SSCP）和PCR异源二聚体电泳多态即PCR指纹图（PCR fingerprinting）分析。DNA分型技术的应用，使HLA型别分析达到了更精细的水平，并因此发现了更多的HLA多态性。尽管采用DNA水平的HLA分型工作有了很大进展，但血清学分型，特别对I类基因产物仍是分型基础，在可以预见的时期内，DNA分型是无法取代它的。但应该强调，WHO-HLA命名委员会已指明，今后凡属新的HLA特异性必须以相应的DNA序列为基础，否则不再予以命名。

HLA是目前所知人体最复杂的遗传多态性系统。HLA研究涉及免疫学、遗传学、分子生物学、医学等多个学科。迄今HLA研究已达到相当深入的水平，并在诸多方面取得显著进展，包括HLA复合体结构；HLA分子结构及其表达的调控；HLA分子功能，尤其是在抗原处理、呈递及T细胞识别中的作用；HLA的DNA分型及多态性研究；HLA与疾病的关系；HLA与移植的关系等。HLA研究不仅使器官移植成为一种极有价值的治疗手段，并给基础与临床免疫带来了突破性进展。已经证实，HLA复合体中存在控制免疫应答的基因以及HLA参与约束免疫细胞间相互作用，这表示HLA涉及生命活动的各个水平与多个方面。可以预期，对HLA的研究将继续成为免疫遗传学最活跃的部分；对HLA的应用将扩展到基础、临床、预防医学的各个领域。