【原理】 ELISA法检测血小板相关抗体（platelet associated Ig，PAIg），将抗人血小板抗体包被在酶标反应板孔内，加入受检血小板溶解液，如此液中存在相关抗体则可与包被的抗体结合，再加入酶标二抗，最后加入底物显色，颜色深浅与血小板溶解液中相关抗体含量成正比，根据测定吸光度值从标准曲线计算出血小板相关抗体含量。
【试剂和仪器】
1.PAIgG检测试剂盒组成
（1）人IgG包被96孔条形板1块，红色标记。
（2）人IgG标准品6.4μg/ml，3瓶。每瓶复溶体积0.5ml。
（3）抗人IgG酶标抗体3瓶，每瓶加20ml蒸馏水复溶。
2.PAIgA检测试剂盒组成
（1）人IgA包被96孔条形板1块，蓝色标记。
（2）人IgA标准品3.2μg/ml，3瓶。每瓶复溶体积0.5ml。
（3）抗人IgA酶标抗体3瓶，每瓶10ml蒸馏水复溶。
3.PAIgM试剂盒组成
（1）人IgM包被96孔条形板1块，黑色标记。
（2）人IgM标准品3.2μg/ml，3瓶。每瓶复溶体积0.5ml。
（3）抗人IgM酶标抗体3瓶，每瓶加20ml蒸馏水复溶。
4.共同试剂
（1）标准品稀释液20ml；1瓶。
（2）酶标板洗涤液20ml；1瓶，用前1:50稀释。
（3）邻苯二胺（OPD）4片。
（4）底物缓冲液40ml，1瓶。
（5）终止剂20ml/瓶，1瓶。
（6）半对数纸1张。
5.血小板收集分离洗涤试剂
（1）5%EDTA抗凝剂，用前加蒸馏水至100ml。
（2）1%草酸铵2g，用前加蒸馏水至200ml。
（3）血小板洗涤液（0.01MEDTA-PBS pH6.5），用前加蒸馏水至2 000ml。
（4）pH7.2的0.3%BSA PBS缓冲液。
（5）11%Triton 12ml。
【操作方法】
1.分离血小板
（1）取一小试管加0.5ml 5%EDTA（试剂1）与待测血4.5ml混匀。
（2）800r/min离心20min，吸取血小板血浆层，置另一试管中，尽量避免吸入红细胞及白细胞，3 000～3 500r/min离心10min，倾去上层血浆，沉淀的血小板中加入1%草酸铵溶液（试剂2）1ml，用移液管吹散沉淀，静置5min以破坏少量污染的红细胞，然后3 000～3 500r/min离心10min，倒置弃尽上清。
（3）用血小板洗涤液（试剂3）5ml/次，洗3次，每次都先吹散沉淀，再以3 000r/min离心10min，最后弃尽上清。
（4）用1ml测定缓冲液（试剂4）将血小板沉淀配成悬液，然后计数以5U/μl以上浓度用于测定。
（5）在1ml血小板悬液中加入11%Triton（试剂5）100μl置4℃冰箱内10min以溶解血板。4 000r/min离心10min，取上清用于测定。
2.PAIgG测定步骤
（1）先将IgG标准品用标准品稀释液复溶。酶标板按所需孔数取出。
（2）标准曲线制作：将复溶后的标准品在酶标板的第一列8个孔中作一连续对倍稀释，第一孔不稀释直接为100μl标准品。得一浓度梯度为6.4μg/ml、3.2μg/ml、1.6μg/ml、0.8μg/ml、0.4μg/ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml。
（3）在测定孔中加入待测标本（上清）100μl/孔，然后在标准品和测定孔中同时加入100μl酶标记抗体，（注：每块板上至少留下一孔作为空白对照，只加标准品稀释液）轻轻振荡混匀37℃60min温育。
（4）倾去液体，用洗涤液洗四次，拍干。
（5）底物OPD1片，加底物缓冲液10ml溶解，摇匀，加入酶标板每孔100μl，37℃5～10min。
（6）用50μl终止剂中止，492nm波长比色，空白孔校零。
（7）在试剂盒所附的半对数纸上，以IgG含量为纵坐标，OD值为横坐标，画出竞争抑制标准曲线。然后以待测标本的光密度（OD值）查曲线求出IgG含量（μg/ml）。
（8）含量计算：
通常PAIgG含量以107个血小板为计算单位。
PAIgG（ηg/107pL）
3.PAIgA测定方法及结果计算同PAIgG 标准曲线的IgA含量梯度为3.2μg/ml、1.6μg/ml、0.8μg/ml、0.4μg/ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml、0.025μg/ml。
4.其他 PAIgM测定方法及结果计算同PAIgG，标准曲线IgM含量梯度同IgA。
【正常参考值】 PAIgG＜60ng/107PL；
PAIgM＜40ng/107PL；
PAIgA＜12ng/107PL。
注：正常值根据不同实验室的具体情况可有所修正。
【临床意义】
1.作为诊断特发性血小板减少性紫癜（ITP）的指标之一，90%以上PAIgG增高，如同时测定PAIgM、PAIgA则阳性率可达100%。
2.作为观察疗效及估计预后的指标，ITP患者经皮质激素治疗有效者，PAIgG在2周内下降，其预后较好。
3.有助于研究其他一些疾病的免疫机制，如系统性红斑狼疮、Evans综合征、慢性活动性肝炎、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤及药物性免疫性疾病等。
【注意事项】
1.所有标准品和复溶体积必须十分准确。
2.标准品及酶标抗体临配临用，不宜将剩余物留作下一次测定。
3.在读数以前建议用附上的软性纸擦净底板水迹及手印，以利准确定量。
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