无创免疫排斥反应监测

在监测器官移植术后免疫排斥反应的方法中，心肌活检自从20世纪70年代起一直作为公认的金标准在全世界广泛采用。但是心肌活检所带来的创伤大、费用高等问题一直困扰着心脏外科医师。一般来说，按照标准的方案心脏移植术后患者在第1年内至少将会接受10次左右的心肌活检以检测其心脏排斥反应的状态，同时在以后的几年里还会定期进行。尽管全世界统计所有心肌活检结果中有75%是阴性的，但是鉴于没有其他理想的替代技术，因此，患者在以后的免疫状态评估时心肌活检还得要常规进行。心肌活检不但费时费力费钱，很多时候还受时间的限制，出现明显症状而进行心肌活检时往往心肌的免疫排斥已经发生和存在一段时间了，也就是说心肌活检不能很好地早期实时监测移植心脏的免疫排斥的状态。因此，心脏移植术后无创免疫检测技术的研究一直是全世界的研究热点，但是目前尚没有理想的无创检测方法。以下简单介绍几种国际无创监测技术的研究热点：

（一）组织多普勒超声技术

组织多普勒超声心动图（tissue Doppler echocardiography，TDE）又被称为组织多普勒成像（tissue Doppler imaging，TDI）或多普勒心肌显像（Doppler myocardial imaging，DMI）。在实际中应用的开端是在1992年、即McDicken将彩色编码技术应用于模拟组织而评价组织速度的大小和方向，从而导致了这项技术在心脏功能评价、心脏激动学研究的广泛应用。通过选择性测量心肌运动获得低速高幅度信号来量化心肌舒张和收缩速率，同时要过滤掉区域内血细胞移动所造成的高速低幅度信号。由于其高度瞬时化和对速度范围的分解，脉冲组织多普勒显像对于诊断心脏移植排斥早期引起的舒张功能障碍特别有效，比传统的超声心动图能更早检测心室功能的变化。

根据心肌组织运动成像方式的不同，TDE平面实时成像分为三类：组织速度成像的彩色二维组织速度图（colour－TVI or colour Doppler myocardial imaging，CDMI）以及基于速度成像的多普勒组织能量图（Doppler　tissue　energy，DTE）、多普勒组织加速度图（Doppler tissue acceleration，DTA）、变应率成像（strain rate imaging，SRI）；彩色M型组织多普勒超声心动图（M－TDE），脉冲组织多普勒超声心动图（PW－TDE）等。非实时成像主要是在获取高帧频二维速度成像基础上的合成重建，即经后处理而得到的成像，主要为曲线化解剖M型技术。

1．组织多普勒技术在心脏功能的研究领域　包括：①左室收缩功能；②左室舒张功能；③右室整体功能：④局部收缩功能和舒张功能。

2．组织多普勒技术在心脏排异监测中的作用　包括：①敏感；②准确测量各种参数；③定量测量室壁运动幅度；④判断局部室壁的舒张、收缩功能；⑤结合二尖瓣口舒张期充盈频谱判断舒张功能减低程度；⑥鉴别心包积液、心肌本身引起的舒张受限；⑦心率依赖、容量依赖少；⑧心脏移植排斥的预测。

目前在心脏移植领域组织多普勒监测技术的指标预测和急性排斥反应的相关性的研究仍然比较少。Aranda－JJ等研究报道移植成功预测的敏感度为93%，特异性为71%。Michael等利用ALOCASSD－2200超声系统研究移植排斥反应的监测结果。结果显示，舒张早期室壁运动峰速和松弛时间对临床排斥反应高度敏感性，相关性分别为90%和93．3%。舒张参数的变化对阴性和阳性预测的灵敏度分别为96%和92%。而收缩参数的变化对于移植物血管病的预测率为92%～97%，排除准确率为80%，结果可用于指导术后长期监测的冠脉造影时间的选择。Michael D．等在心脏移植术后心肌排斥反应监测中尝试了组织多普勒技术，研究中尝试了多种指标，具体包括：①收缩期室壁运动峰速Sm（peak systolic wall motion velocity）；②舒张早期室壁运动峰速Em（peak early diastolic wall motion velocity）；③收缩时间TSm（systolic time，从第一心音到收缩运动峰速时间）；④舒张早期时间TEm（early diastolic time，从第二心音开始到舒张早期峰值）；⑤收缩和舒张早期室壁加速度Sm／TSm，Em／TEm（systolic and early diastolic wall accelerations）。在研究中发现，Sm和Em在心脏移植术后发生排斥反应时均明显降低，而TSm则有明显延长的变化。

总之，组织多普勒技术无论在心脏功能还是在心脏电生理方面均发挥着巨大的作用，尤其是近年来在二维基础上的合成重建即后处理功能的强大将会使这一技术更加成熟。TDE的腔内成像、三维成像将促使它的应用研究领域更加广泛，多形式实时成像的显示更有助于开阔我们对心肌组织病理的研究的视野。

（二）心肌内心电图技术

在开展心脏移植的早期阶段，人们就认识到排斥反应会改变QRS波群的电压值。免疫排斥时的特征性病理变化——淋巴细胞对移植物的浸润，间质水肿，心肌细胞的坏死，会引起相关心肌组织电传导特性的变化。因此，在早些时候有人用体表心电图QRS波幅的变化来监测免疫排斥反应的发生，但体表心电图和QRS波幅的变化可能是由外界因素引起的，例如体重、电极的具体位置和电解质的失衡等，会影响最终结果的准确性。另外，随着环孢素的使用，典型的排斥反应期间心肌间质广泛水肿的情况越来越少见，而排斥反应期间心电图的改变也越来越少监测到。因此，传统的体表心电图并非是监测排异反应的可靠方法。虽然某些时候心电图的细微变化确实也提示排斥反应的发生，但是它和组织学检查结果的相关程度却远未达到能作为一诊断工具的地步。Keren为了提高诊断的效率，使用了均一信号的心电描记方法，发现诊断的灵敏度可达82%，特异性达81%。然而，这种方法操作复杂，结果并非完全可靠。利用快速Fourier转换体表心电图的QRS波谱分析也可以提高诊断排斥反应的敏感度（敏感度为93%而特异性为83%），Haberl首先介绍了利用快速傅立叶变换（FFT）进行心电图频谱分析，对体表心电图中的QRS复合波及ST段进行频谱分析中发现，发生AR时，70～l10Hz范围的频率强度大大增加，曲线下面积（AUC）增加，并在抗排斥反应治疗后的1～2周恢复正常。异位HT模型研究显示，应用FFT进行QRS频谱分析，对于早期判断AR的价值有限，而且不能提示AR是否有进展。

但同样各家结果报道均不一致。Valention等考察了61例用快速Fourier转换记录的平均信号心电图的频率范围。在该研究中，作者认为移植排斥会增高QRS波群的高频内容。而Graceffo和O’Rourke却发现在排斥反应中QRS波群的平均信号中的高频内容相对减少。由Morocutti等进行的进一步研究发现，排斥反应时的后电位发生率达70%。在该研究中，当均化信号和超声心动图参数联合在一起时，这些技术的联合使用会达到一个100%的敏感度，但特异性仅有60%。

从20世纪80年代开始，由德国柏林心脏中心为代表的研究中心开始对描记心肌内心电图（intromyocardiam electrogram，IMEG）在监测移植排斥反应的作用进行了一系列深入的研究。在移植手术中植入一具有遥感功能的起搏器，通过心外膜表面置入的电极可以描记出心肌内心电图的情况。心肌内心电图与体表心电图相比较，所受的外界影响因素更少，信号更稳定，能够准确反映出局部心肌的电生理变化情况，因此，在临床的应用逐渐受到重视。Muller等对558名心脏移植病人进行了心肌内心电图监测，并与心内膜活检对比，其灵敏度为97．77%，特异性为96．34%，假阳性率为1．50%，且使得285名病人避免了常规心内膜活检。在一组总数为32例的前瞻性病例研究中，Warnecke等用一双腔起搏器描记心肌内心电图来代替常规心内膜活检。基于早期的研究结果，在夜间长时间描记中QRS电压压低超过个体变异范围8%以上的提示有排斥反应发生。超声心动图中Te间期延长超过20ms可以作为另一个附加指标。考虑到安全性因素，心内膜活检作为研究的一部分照常进行，但结果对移植治疗组人员保密。一共治疗了27例排斥反应，其中22例是通过无创方法诊断。在4个病人中，由于无创指标无法除外排斥反应而进行心内膜活检，结果诊断为排斥反应，进行了治疗。研究中未观察到假阴性结果，回顾性分析这两种方法与排斥反应关系，发现心肌内心电图描记的阴性预见率为100%，而超声心动图的阴性预见率为96．9%。

尤其在儿童病人移植中，进行心内膜活检的难度大，心肌内心电图描记看来比目前所用的其他排斥监测方法都要优越。Hetzer等在一组69例的儿童病例中通过IMEG监测病人术后的排斥情况，并没有发生与排斥反应相关的死亡。每日的心肌内心电图描记还能早期监测到排斥反应的发生并及时治疗，从而减少移植血管病的发生率，改善这些儿童病人的远期生存率。

所进行的实验研究也发现，心肌内心电图在诊断体液介导的排斥反应中也具有极好的准确率，诊断灵敏度达到100%。这是心肌内膜活检所不能做到的。

Iberer等发现，在起搏状况下心肌内心电图的复极过程中可能包含着反映排斥反应的心电参数。VER（vent icular evoked response）是指心室对外界刺激的反应，它是一个非常稳定的电生理信号，可以作为长期性的无创监测指标，能够反映出由排斥反应引起的心脏病理改变所继发的电生理活动变化。由非排斥因素引起的心肌组织间淋巴细胞浸润在心肌活检下会得到假阳性的结果，如果这种变化不是活动性，就不影响心肌电生理活动，VER不会发生变化，这种改变临床上无需处理；而对于不引起淋巴细胞浸润的体液排斥反应，心肌活检结果为阴性，而VER却会发生变化。通过在一系列多中心研究中发现，心室起搏所引起的心室刺激反应幅度的变化与排斥反应有关。这些研究结果都证明了这一方法具有很好阴性预见率，能够在大多数病人中避免了心内膜活检的使用。Bourge等报道了在一项美国的多中心研究中，有30例病人在移植时置入了2根具有高清晰度遥感起搏功能的起搏电极。通过起搏器可以记录下自发和起搏下的心电活动并将数据用一数字化信号获取器存储起来。研究表明，这一方法的阴性预见率达98%，分析表明有55%的侵入性心内膜活检可以得以避免。而Grasser等还研究了起搏频率、由自主心律变为起搏心率以及体位变化对心电图诊断参数的影响。他们建议对于心室刺激反应的分析应该在每天的相同时候进行，以相同的起搏心律，并在测量前至少让病人休息5min以上。根据Grasser等最近报道的研究结果，VER中T波下降阶段的最大斜率（T－slew）在排斥反应级数2级及2级以上的病人中明显降低，降到基础值90%以下可以作为诊断排斥反应的指标，诊断排斥反应的阴性预见率可达99%；而能减少74%的心内膜活检次数。

柏林心脏中心新近研制出一个心肌内心电图描记系统，这是一款可置入性的多感装置，称MUSE，可以通过电话线将所测量的心肌内心电图、心肌阻抗和左室动力性增厚数值等数据传送到分析中心。在已观察的14名病人中，MUSE检测排斥反应的敏感度为100%，特异性达96%。MUSE可以减少活检和超声心动图检查的次数（图4－4）。然而，由于目前进行研究的病例尚少，还需要大病例数的前瞻性多中心研究来考察这一方法。

图4－4　德国心脏中心－柏林历年心肌活检次数逐渐减少

并非所有的用心肌内心电图进行免疫排斥监测的研究报告结果都与上述的研究结果一样令人鼓舞。来自Papworh医院的Bainbridge等研究了45例移植病人，每日测量起搏下的T波幅度作为诊断排斥反应，发现诊断排斥反应的敏感度仅为55%，特异性为62%；诊断移植排斥的阳性预见率为30%，阴性预见率为83%。因此，并不是所有的研究结果都具有高度阴性预见率，在这项令人感兴趣的技术广泛应用前需要进行更多的调查研究。

北京安贞医院于2003年在我国率先开展了心肌内心电图的基础和实验研究，通过大量动物实验积累了一定的数据和经验，并初步应用于临床。目前对28例心脏移植病人监测的结果，结合心肌活检分析，诊断排斥反应的敏感度为95%，特异性为75%。

有大宗的回顾性研究表明，可日常进行的无创排斥反应监测系统可提高心脏移植病人的远期存活率。目前来看，最安全、方便、有效，和最有前景的排斥监测手段是电生理和组织多普勒，心电生理方法具有连续、无创、远距、可连续进行测量的特性，而心脏超声技术使得能够安全评估心脏结构和功能的变化，能够进一步减少心内膜活检的需要。将几种无创监测手段结合起来建立一个排斥反应诊断评分系统，可能是未来临床研究的方向之一。当然，这需要多中心联合的、大样本的回顾性和前瞻性分析。

（三）外周血淋巴细胞分子生物学技术

近年来获得技术重大突破的外周血无创实时的分子生物学检测技术是最有希望获得临床推广应用的方法之一，已经引起全世界越来越多的器官移植专家的重视。2006年4月的国际心肺移植年会上，综合采用最新分子生物学技术的异体器官移植基因图谱检测技术（AlloMap）被设为一个独立的大会专题，来自全世界各国的众多移植专家对其进行了热烈的讨论。

分子生物学AlloMap技术简介：分子生物学技术监测免疫排斥反应在心脏移植领域的应用是一个崭新的重要课题，其原理为使用定量实时反转录聚合酶联反应（RT－PCR）技术，利用对血液中单核粒细胞等免疫细胞的成千上百种信使核糖核酸（mRNA）基因表达状态的筛选分析，来评估机体的免疫排斥系统的实时状态，从而迅速及时地监测机体对移植物的排斥反应程度。事实上，利用外周血淋巴细胞的不同种类基因表达来预测移植术后的免疫排斥反应在近几年来一直是人们研究的热点，众多研究结果显示，涉及机体免疫排斥反应的多种基因表达的监测都可能与临床心肌活检所确定的免疫排斥程度具有相关性，但是具体哪一种或者哪几种基因的相关性最好，对于大样本的临床观察结果会如何，种种类似的问题一直没有得到较好的回答。直到研究协作组的Allo－Map技术在美国几家先进移植中心的初步研究获得令人满意的结果，才预示着在此领域的无创实时检测研究真正走向了临床应用阶段。

Yamani MH在2005年报道了在69例心脏移植患者的利用AlloMap技术进行实时免疫排斥检测的研究，结果显示，心脏移植术后血管增殖疾病患者的AlloMap评分远高于冠脉正常的移植患者（分别为32．2±3．9，26．1±6．5，P＜0．001）。2006年，国际心肺移植年会上哥德比来大学心脏移植研究中心主任M．C．Deng报道了使用Allomap来监测和预测心脏移植术后慢性冠脉增殖性疾病的的初步结果，这些研究检测了与慢性冠脉增殖性疾病相关的基因表达，提示心脏移植术后早期不同的基因表达形式可以预测将来发展慢性冠脉增殖性疾病的风险。2005年总结了美国5家使用无创外周血分子生物学检测和心肌活检的经济学费用的对比，心肌活检至少要花费3　297美元，而使用无创外周血分子生物学技术则可以明显减少其费用，全美国至少可以每年节省1　200万美元。在2006年4月，在国际心肺移植大会上维也纳大学心脏外科O．Zwkermann博士报道了AlloMap这一在临床应用的结果，并分析了将来可能推广的应用方案。他指出Allomap检测自从2005年出现以来很快被一些移植中心采用，并被越来越多的机构用作为心肌活检外的临床免疫排斥监测方法，还将继续评估所有的数据结果。这种分子学监测是心脏移植领域巨大的进展，是一种移植患者很容易接受的免疫监测方法。多伦多大学心胸外科主任Shaf　Keshavjee讨论了肺移植应用AlloMap进行免疫监测的结果，提示AlloMap也可以成功地用于心脏外其他的器官移植的监测。

总之，这种无创实时的免疫检测技术已经在国际上一些先进移植中心得到成功应用，取得了令人兴奋的初步成果，而且从2005年4月开始进行的CARGOⅡ研究已经把范围扩展到欧、美、澳三大洲19个心脏移植中心，有计划地在国际范围内进行深入的研究。其目标包括：①在国际范围内鉴别诊断患者有无免疫排斥反应；②预测将来的急性细胞排斥反应和移植物的功能衰竭；③检测和指导免疫抑制药物；④诊断和预测体液排斥反应；⑤心脏移植患者慢性冠脉血管性疾病的危险分级。在2006年4月的国际心肺移植年会上，众多国际移植专家一致认为，CARGOⅡ的研究将给心脏移植研究领域提供无与伦比的基因和分子诊断研究资源，将会在移植术后无创免疫检测领域开辟有效的新途径。