细胞复苏与冻存

（一）实验目的

细胞培养（cell culture）是指在无菌、适当温度和一定营养条件下，使细胞在体外生存和生长并维持其结构和功能的方法。细胞可以冻存，并且经过复苏后能够恢复其原有的结构和功能。细胞复苏和冻存技术是细胞培养的基本技术。

（二）实验试剂

细胞冻存液［成分为含20%DMSO的胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）］、0.25%胰酶。

（三）实验流程

1.复苏

（1）从液氮中取出冻存细胞，快速解冻。

（2）将冻存细胞液从冻存管中快速移出，加入到10ml的无血清培养液中（小离心管），轻轻混匀。

（3）离心（1200r，5min）。

（4）弃上清。

（5）加入10ml10%FBS培养液，反复吹打混匀。

（6）接种细胞到25cm×25cm培养瓶（5ml培养液），置于37℃CO2温箱中培养。

2.冻存

（1）0.25%胰酶消化培养细胞（1ml/培养瓶），37℃CO2温箱孵育3min后，加入2ml培养液终止消化。

（2）培养瓶中液体转移至10ml离心管。

（3）离心（1200r，5min）。

（4）弃上清。

（5）加入0.5ml10%FBS培养液，反复吹打混匀。

（6）加入0.5ml细胞冻存液，反复吹打混匀。

（7）将混合后的液体移至冻存管（1.8ml），置于-20℃冰箱保存2h，再移到-80℃冰箱，24h后放入液氮中永久保存。

（四）注意事项

1.遵循慢冻快复苏原则。冻存细胞要逐渐递减温度，复苏时操作动作尽量快，减少冻存液在室温情况下对细胞的损伤。

2.由于冻存管相对较小，更要注意无菌操作，防止细胞污染。

3.为了观察细胞冻存后是否存活，需要定期复苏细胞，观察复苏存活率，保障冻存细胞的活性。

（五）常见问题及处理方案

1.细胞冻存复苏后，大量细胞死亡或者漂浮细胞过多，怎么办？

答：①细胞冻存时状态一定要好，汇合度70%～80%为宜，冻存细胞状态不好，直接导致细胞复苏后很难成活。②细胞短期可以放置在-80℃冰箱，但长期保存必须要放置在液氮中。频繁地开关门将直接导致细胞冻存效果受影响，复苏后可导致大量细胞死亡。③细胞复苏后一定时间内不要移动培养瓶，保证细胞良好的生存状态。贴壁细胞如果不能及时贴壁附着，很难成活。④对于贴壁细胞，在一定时间内需要通过换液来清除漂浮细胞或死亡细胞，不要让它们影响已经成活细胞的生长。换液时间酌情而定。⑤对于相对不易于培养的细胞类型，如足细胞，需要酌情在培养瓶中提前铺好胶原等辅助细胞贴壁的试剂，然后进行复苏。⑥对于悬浮细胞的复苏，要根据细胞显微镜下的细胞生长情况及时收集离心换液处理。

2.细胞反复冻融后，细胞性状是否发生改变？

答：我们一般要从形态学观测，另外要对细胞进行相关生物学检测才能下结论。但首先要先排除培养环境对细胞的干扰，如：培养液的pH，培养液的种类选择等。