原代近曲肾小管上皮细胞的分离培养

（一）实验目的

肾小管上皮细胞是肾脏重要的固有细胞，不仅具有重吸收和排泄功能，而且能够分泌众多的细胞因子、生长因子、血管紧张素及炎症介质，参与肾组织纤维化的发生和进展。肾小管上皮细胞的增殖、凋亡、再生、参与免疫炎症等都与肾组织纤维化进程密切相关。因此，原代近曲肾小管上皮细胞培养技术是肾脏细胞生物学的重要部分。

（二）实验试剂

1.Ⅴ型胶原酶（13.6mg/ml）。

2.细胞培养用液　10%FBSDMEM含上皮细胞生长因子（Epidermal growth factor，EGF，10ng/ml）、胰岛素（Insulin，10ng/ml）、转铁蛋白（Transferrin，5μg/ml）。

3.KHB缓冲液（配方见附录）。

4.PERCOLL分离液　广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。

（三）仪器

灌注泵等。

（四）实验流程

1.灌注方法

（1）100～150gSD（Sprague Dawley）大鼠，乙醚麻醉，腹主动脉插管，全身肝素化。

（2）灌注生理盐水，清洗肾脏2min，直到肾脏变白为止。利用灌注泵用Ⅴ型胶原酶在37℃水浴循环消化15min。

（3）观察到双侧肾脏变软后，用生理盐水冲洗肾脏，迅速放置冰浴缓冲液中。

（4）用无菌刀片仔细剥离肾皮质，加入缓冲液，移到10ml离心管中。

（5）通过210μm筛网过滤，在80μm筛网上收集组织，将收集物悬浮于KHB缓冲液中。

（6）清洗和离心3min，800r×3次，利用PERCOLL分离液进行分离，组织经离心后分层。

（7）在显微镜下观察各层组织，收集近曲小管层，加入10%FBSDMEM中，放置于37℃CO2孵箱中进行培养。

2.培养　倒置显微镜下观察肾小管纯度达98%以上后，置于37℃5%CO2孵箱中，培养1周左右，即可见原代肾小管上皮细胞生长并融合成片。

（五）注意事项

图1-1　近曲肾小管荧光显微镜下形态（×200）

1.大鼠动物手术操作相对复杂，如果不能结扎分支血管，很可能导致灌注消化不充分，造成肾脏组织分离不开。

2.实验操作过程相对要快些，时间过长容易导致组织细胞活性降低。

3.用PERCOLL分离液进行分离后，收集近曲小管层，尽量保证纯度，宁纯勿杂。

（六）细胞鉴定

细胞鉴定采用间接免疫荧光染色法，即肾小管上皮细胞抗细胞角蛋白及抗角蛋白染色阳性。

（七）培养的近曲肾小管上皮细胞

见图1-1。

参考文献

[1]田劲，陈香美，黎磊石，等.冬虫夏草、大黄及肾大部切除大鼠血清对肾小管上皮细胞生长的影响.中西医结合杂志，1991,11:547-549.

[2]傅博，陈香美，李文歌，等.用微分离方法培养肾皮质近曲小管和髓质集合上皮细胞及其生物学特征的研究.解剖学杂志，1999,22:63-66.

[3]李文歌，陈香美，程庆砾，等.用共培养体系观察缺氧肾小管上皮细胞对成纤维细胞的调节作用.中华内科杂志，1996,35:810-813.

[4]Wang J,Ouyang C,Chen X,et al.STAT3 inhibits apoptosis of human renal tubular epithelial cells induced by ATP depletion/recovery.Nephron Exp Nephrol,2008,108:e11-18.

附：KHB缓冲液配方　表1-1

表1-1　KHB缓冲液配方

注：无菌滤过，4℃保存